Оптимизация уродинамических методов мыши для повышения точности

Резюме

Этот протокол содержит руководство по гидроизоляции кожи цианоакрилатом для предотвращения впитывания мочи шерстью и кожей. Он включает в себя инструкции по нанесению клея на кожу, имплантации катетера мочевого пузыря, а также электроды для цистометрии и записи электромиографии наружного сфинктера уретры у бодрствующих мышей.

Аннотация

Точное измерение параметров мочи у бодрствующих мышей имеет решающее значение для понимания дисфункции нижних мочевыводящих путей (СНМП), особенно при таких состояниях, как нейрогенное посттравматическое повреждение спинного мозга (ТСМ) мочевого пузыря. Тем не менее, проведение записи цистометрии у мышей представляет собой заметную проблему. Когда мыши находятся в положении лежа и ограничены во время сеансов записи, моча имеет тенденцию поглощаться шерстью и кожей, что приводит к недооценке объема мочеиспускания (VV). Целью данного исследования было повышение точности регистрации цистометрии и электромиографии наружного сфинктера уретры (ЭУС-ЭМГ) у бодрствующих мышей. Мы разработали уникальный метод с использованием цианоакрилатного клея для создания водонепроницаемого кожного барьера вокруг уретрального прохода и брюшной полости, предотвращая всасывание мочи и обеспечивая точные измерения. Результаты показывают, что после применения цианоакрилата сумма VV и RV оставалась в соответствии с объемом введенного физиологического раствора, и после эксперимента не наблюдалось влажных участков, что указывает на успешную профилактику абсорбции мочи. Кроме того, метод одновременно стабилизировал электроды, соединенные с наружным сфинктером уретры (ЭУС), обеспечил стабильные сигналы электромиографии (ЭМГ) и минимизировал артефакты, вызванные движением пробужденной мыши и манипуляциями экспериментатора. Обсуждаются методологические детали, результаты и последствия, что подчеркивает важность совершенствования уродинамических методов в доклинических исследованиях.

Введение

Накопление и выделение мочи зависят от скоординированной деятельности мочевого пузыря и наружного сфинктера уретры (ЭУЗ). При некоторых патологиях, таких как нейрогенный мочевой пузырь, мышцы детрузора мочевого пузыря и сфинктер могут стать дисфункциональными, что приводит к значительным проблемам с мочевым пузырем, особенно после травматического повреждения спинного мозга (ТСМ)¹.

Мелкие грызуны обычно используются в качестве экспериментальной модели для изучения доклинической функции нижних мочевыводящих путей (СНМП)². Методы записи заполняющей цистометрии (ФК) и электромиографии ЭУС (ЭУС-ЭМГ) могут предоставить точную объективную информацию в зависимости от выбора методов, точного измерения и интерпретации результатов³. Уродинамические тесты обычно используются для оценки объема мочеиспускания (VV), эффективности мочеиспускания (VE) и емкости мочевого пузыря⁴. VE измеряет, насколько эффективно мочевой пузырь может опорожняться. Он рассчитывается путем деления аннулированного объема на сумму аннулированных и остаточных объемов (VV+RV). С другой стороны, емкость мочевого пузыря рассчитывается путем прибавления ВВ (количество мочи, выделяемой во время мочеиспускания) к ВВ (количество мочи, оставшейся в мочевом пузыре после мочеиспускания)⁵. Таким образом, измерение VV и RV является ключом к выведению других параметров.

Точное измерение ВВ у мышей во время уродинамических тестов сопряжено с различными проблемами. Моча грызунов, когда ее физически удерживают в положении лежа, имеет тенденцию оттягиваться вниз через вентральную брюшную стенку под действием силы тяжести⁶. Это явление может привести к поглощению мочи мехом и кожей живота, что, в свою очередь, занижает объем выделяемой мочи. Учитывая небольшое количество мочи, выделяемой мышами, влияние этой абсорбции на точность результатов еще более выражено⁷. Кроме того, в моделях ТСМ VV часто ниже, чем у нормальных мышей, из-за влияния диссинергии детрузорного сфинктера (DSD), что увеличивает риск давления в точках утечки и абсорбции мочи мехом⁸. Эти факторы оказывают существенное влияние на результаты. Таким образом, точное измерение ВВ и ПЖ во время терминальных уродинамических исследований у мышей имеет решающее значение⁹. В настоящее время в методологиях, представленных в опубликованной литературе, отсутствует подробная информация о том, как точно измерить объем мочи на мышиных моделях.

Цианоакрилатный клей - это тип клея, который обычно используется в хирургических процедурах на моделях человека и животных благодаря его быстрым и эффективным склеивающим свойствам 10,11,12. Этот клей особенно полезен для закрытия ран и рваных ран, так как при нанесении на кожу он образует прочное и гибкое соединение¹³. Кроме того, он может быть отличным барьером против мочи и влаги, которые могут соприкасаться с шерстью и ранами¹¹.

В этой статье мы разработали новую и экономически эффективную методику, в которой используется цианоакрилатный адгезив для достижения точных результатов в цистометрии и регистрации EUS-EMG у бодрствующих мышей. Этот метод будет полезен для понимания основных причин дисфункции мочевого пузыря и разработки более эффективных методов лечения расстройств СНМП.

протокол

Протокол исследования на животных был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Индианы. Код утверждения: 21098MD/R/MSS/HZ Дата утверждения: 29 сентября 2021 г.

1. Подготовка катетера

1. Отрежьте полиэтиленовую трубку PE-30 диаметром 30 см (0,017 дюйма x 0,030 дюйма). Используйте зажигалку, чтобы раздуть один конец трубки, следя за тем, чтобы он не касался пламени, и вытащите зажигалку, как только трубка образует подходящий круглый наконечник в форме колокола.
2. Осторожно введите около 3/4 иглы 25G в другой конец трубки. Приготовьте шприц объемом 1 мл и наполните его стерильным 0,9% NaCl. Подсоедините шприц к игле 25 G.
3. Осторожно влейте физиологический раствор, чтобы убедиться в правильности круглого кончика и отсутствии вытекания с концов иглы. Убедитесь, что давление не ощущается и физраствор плавно течет через катетер.

2. Подготовка электродов

1. Подготовьте 2 стальные проволоки длиной 20 см. Возьмите стальную проволоку и нанесите песочный лак на оба конца зоны покрытия, чтобы зачистить 5 мм проволоки.
2. Возьмите иглу 25G и вставьте ее с одной стороны проволоки. Обязательно вставляйте иглу осторожно, чтобы не повредить проволоку. Согнуть зачищенную часть проволоки как крючок. Крючок поможет соединить провод с мышцей ЭУС.
3. С помощью припоя прикрепите штифт к другому концу полосатого провода. Пайка поможет закрепить штырь на проводе и обеспечить прочное соединение. Обязательно нагрейте оловянно-свинцовую пайку до тех пор, пока она не расплавится и не покроет провод и контакт.

3. Подготовка животного

1. Содержать самку мыши C57BL/6 (8 недель, масса тела 18-20 г) в помещении для животных в соответствии с Institutional Animal Care с 12-часовым циклом свет-темнота и неограниченным доступом к воде и стандартным кормовым гранулам.

4. Обезболивание во время операции

1. Поместите животных в камеру с 2% изофлураном и чистым кислородом (1 л/мин). Подтвердите полную анестезию животного с помощью отрицательного исследования пальцев ног перед переносом его в маску. После подтверждения измените газовое состояние на маску.
2. Убедитесь, что маска для анестезии зафиксирована в соответствующем положении на стерильном операционном поле. Положите животное лежа на стерильную простыню носом в небольшую ингаляционную маску (0,8-1 л/мин с 2% изофлураном) для продолжения введения анестезии.

5. Хирургическая подготовка

1. Зафиксируйте конечности животного скотчем. Используйте электрическую бритву, чтобы сбрить шерсть в нижней части живота и вокруг уретрального прохода (области гениталий).
2. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить возможную сухость глаз. Подготовьте выбритый участок с помощью раствора повидон-йода и сотрите раствор 70% этанолом. Наложите стерильную простыню на область операции.

6. Хирургическое вмешательство

1. Имплантация катетера мочевого пузыря
   1. Под операционным микроскопом, используя прямые тупые ножницы Метценбаума, создают разрез 1-2 см по средней линии кожи брюшной полости. Приступайте к надрезу фасции и мышц по средней линии, чтобы обнажить мочевой пузырь через режущую рану.
   2. Как только мочевой пузырь станет виден через разрезную рану, продолжайте втягивать все окружающие органы или ткани по мере необходимости, чтобы получить четкий обзор операционного поля. Будьте осторожны, чтобы избежать любых ненужных манипуляций или напряжения мочевого пузыря, так как это может привести к осложнениям, таким как подтекание мочи или повреждение окружающих структур.
   3. Возьмитесь за купол мочевого пузыря и поместите кошельковую веревку, используя нерассасывающийся шов из мононити 5-0 с иглой с коническим кончиком.
   4. С помощью микроножниц создайте небольшую цистостому в кошельке и сделайте отверстие до тех пор, пока моча не вытечет.
   5. Возьмитесь за круглый конец катетера и вставьте его через отверстие. Как только кончик трубки пройдет через отверстие, зашите кошельковую веревку вокруг трубки. Затем аккуратно потяните трубку наружу, пока кончик не прощупается под швом.
   6. Медленно влейте 1 мл физиологического раствора с другого конца трубки, чтобы расширить мочевой пузырь. Проверьте наличие протечек вокруг катетера. Если подтекание присутствует, наложите дополнительный шов.
   7. Как только физиологический раствор выйдет из мочеиспускательного канала, извлеките физиологический раствор для декомпрессии мочевого пузыря.
2. Имплантация электродов EUS (Рисунок 1)
   1. Используйте хирургические ножницы, чтобы расширить разрез брюшной полости до тазового дна.
   2. На одной линии с мочевым пузырем переместите мышцы и мембраны к половым каналам и найдите уретру и внешнюю мышцу сфинктера. Будьте осторожны, чтобы не повредить подвздошные и средние каудальные сосуды и половые нервы.
   3. Проколите кожу с двух сторон на расстоянии 1 см от прохода уретры с помощью иглы, содержащей электрод.
   4. Осторожно возьмитесь щипцами за кончик крючка и аккуратно оттяните иглу от кожи.
   5. С помощью кончика электрода осторожно зацепите мышцу EUS с обеих сторон. Избегайте слишком глубоких ударов, так как это может повредить мышцы, что может привести к возможной утечке мочи.
   6. Используйте нерассасывающуюся мононить 3-0 для наложения швов на мышцы таза и живота, а также на кожу.
3. Гидроизоляция кожи
   1. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на кожу в месте выхода электродов, чтобы зафиксировать электроды на месте.
   2. Нанесите цианоакрилатный клей на расстоянии 1 см вокруг уретрального прохода и на 3 см дальше на живот и зашитую область. Чтобы избежать попадания клея, аккуратно удерживайте меатус вверх щипцами.
   3. С помощью микропипетки объемом 0,5-10 мкл выведите жидкость-ускоритель, чтобы высушить клей.
      ВНИМАНИЕ: Жидкость ускорителя является горючей жидкостью.
   4. Добавьте жидкость-ускоритель, чтобы обеспечить правильную адгезионную реакцию. Это поможет быстрее высохнуть клею и обеспечить его надежное схватывание.
4. Уродинамическая подготовка
   1. Подготовьте лодку из перевернутого полистирола весом 4,5 см в длину, ширину и глубину. Разрежьте его в форме треугольника с основанием 4 см, чтобы поместить в это пространство уретру мыши на этом пространстве. Положите одноразовую форму для основания 37 мм x 24 мм x 5 мм под пространство для сбора мочи.
   2. Переместите мышь в положение лежа и осторожно переместите ее на изготовленную на заказ пластину, оснащенную противогазом.
   3. Убедитесь, что уретральный проход правильно расположен в бороздке. Аккуратно зафиксируйте голову и конечность мыши скотчем и поместите пластину на грелку до тех пор, пока мышь не придет в полное сознание (рисунок 2).
   4. Проводите цистометрию только тогда, когда мышь полностью проснулась, то есть не менее чем через 40 минут после восстановления после анестезии.

7. Цистометрия и подготовка к записи EUS-EMG

1. Настройте и откалибруйте инфузионный насос в соответствии с инструкциями производителя.
2. Возьмите шприц объемом 20 мл диаметром 19,05 мм и наполните его стерильным 0,9% NaCl комнатной температуры. Закрепите шприц на инфузионном насосе. Установите скорость инфузии на 0,01 мл/мин.
3. Подсоедините шприц за трубку PE-30 с одной стороны трехконтактного разъема. Подсоедините катетер мочевого пузыря с другой стороны к датчику давления. Перед подключением катетера для мочевого пузыря обязательно удалите все пузырьки воздуха.
4. Зафиксируйте датчик давления на том же уровне, что и мочевой пузырь мыши. Преобразователь давления подключается через усилитель к системе сбора данных.
5. Прикрепите один крючок линии заземления к коже, а другой — к местам подключения электродов. Запишите давление в программном обеспечении.
6. После запуска программного обеспечения проверьте внутрипузырное давление (IVP) и сигналы EUS-EMG. Сохраните имя образца и установите время.
7. Запустите инфузию с помощью насоса. Записывайте сигналы.

Результаты

Для анализа данных использовали цисометрию и отслеживание активности ЭУС-ЭМГ. Метод непрерывной цистометрии предполагает вливание физиологического раствора в мочевой пузырь и одновременное измерение изменения давления и объема мочевого пузыря. Для измерения ВВ 0,4 мл физиологическо?...

Обсуждение

Этот уродинамический метод описывает усовершенствованную процедуру измерения объема мочи и сигнала ЭУС-ЭМГ у бодрствующих и удерживаемых мышей. Наличие шерсти вокруг уретрального прохода и области живота может мешать точности измерения ВВ из-за поглощения мочи. Хотя шерсть вокруг ур...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accelerator	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate	TED PELLA, Inc	14478
Disposable base mold	TED PELLA, Inc	27147-4
Infusion pump	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Polyethylene Tubing 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Sterile Weighing Boat	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022