Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию

Резюме

Этот протокол демонстрирует лазерную клеточную абляцию отдельных нейронов у интактных личинок дрозофилы . Метод позволяет изучить эффект снижения конкуренции между нейронами в развивающейся нервной системе.

Аннотация

Протокол описывает однонейронную абляцию с помощью 2-фотонной лазерной системы в центральной нервной системе (ЦНС) интактных личинок Drosophila melanogaster . Используя этот неинвазивный метод, развивающаяся нервная система может быть манипулирована клеточно-специфическим образом. Нарушение развития отдельных нейронов в сети может быть использовано для изучения того, как нервная система может компенсировать потерю синаптического входа. Отдельные нейроны были специально удалены в системе гигантских волокон дрозофилы, с акцентом на два нейрона: пресинаптическое гигантское волокно (GF) и постсинаптический терготровертельный моторный нейрон (TTMn). GF синапсируется с ипсилатеральным TTMn, который имеет решающее значение для реакции побега. Удаление одной из GF в мозге^3-го возраста, сразу после того, как GF начинает рост аксонов, навсегда удаляет клетку во время развития ЦНС. Оставшаяся GF реагирует на отсутствующего соседа и образует эктопическую синаптическую окончанию к контралатеральной TTMn. Этот атипичный, билатерально симметричный терминал иннервирует оба ТТМ, как показано на примере связи красителя, и приводит в движение оба моторных нейрона, как показывают электрофизиологические анализы. Таким образом, абляция одного интернейрона демонстрирует синаптическую конкуренцию между двусторонней парой нейронов, которая может компенсировать потерю одного нейрона и восстановить нормальные реакции на цепь побега.

Введение

Лазерная абляция является предпочтительным инструментом для препарирования нейронных цепей в самых разных организмах. Разработанная в модельных генетических системах, таких как черви и мухи, она была применена в животном мире для изучения структуры, функций и развития нервной системы ^1,2,3. Здесь абляция одного нейрона была использована для изучения того, как нейроны взаимодействуют во время сборки цепи у дрозофилы. Система побега мухи является излюбленной схемой для анализа, потому что она содержит самые большие нейроны и самые большие синапсы у взрослой мухи, и эта....

протокол

Все животные, использованные для составления протокола, принадлежали к виду Drosophila melanogaster. Нет никаких этических проблем, связанных с использованием этого вида. Для выполнения этой работы не требовалось этического разрешения. Подробная информация о видах дрозофил, реагентах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Разведение дрозофилы и выбор правильной личиночной стадии

1. Выберите линию драйвера Gal4, которая управляет экспрессией в ячейках, подлежащих абляции, и рекомбинируйте ее с репортерной линией UAS-GFP или пересека....

Результаты

Этот метод может быть использован для манипулирования развитием специфических нейронных сетей в нервной системе дрозофилы. Основным вопросом исследования здесь было формирование синаптических связей. Удаление либо пресинаптического GF, либо постсинаптического TTMn позволило исс?.......

Обсуждение

Клеточная абляция с помощью 2-фотонного микроскопа оказалась весьма успешным методом манипулирования развитием нейронных цепей у дрозофил. Так как этот метод является неинвазивным, он наносит минимальный ущерб животному. Полученные данные подтверждают полезность этого специфич.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185