JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Полученные из ИПСК 3D органоиды печени человека представляют собой потенциальный инструмент для понимания действия гормона щитовидной железы на развитие печени.

Аннотация

Получение стабильных клеток печени в культуре представляет собой значительную проблему для исследований печени. Учитывая это, был представлен оптимизированный метод с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) для получения 3D-культур органоидов печени человека (ГХО). Использование HHO предлагает ценный подход к пониманию развития печени, разгадке заболеваний печени, проведению высокопроизводительных исследований для разработки лекарств и изучению потенциала трансплантации печени. В первом исследовании, с помощью иммунофлюоресценции и количественных методов ОТ-ПЦР, отслеживалось прогрессирование, выявляя присутствие различных клеточных популяций, таких как гепатобласты и два типа клеток, полученных из гепатобластов: холангиоциты или гепатоцитоподобные клетки, на разных стадиях развития. В этом отчете представлен простой 3D-протокол, начиная с ИПСК и заканчивая приобретением HHO, которые отражают стадии развития человеческого эмбриона. Протокол, охватывающий 46-50 дней, включает в себя несколько этапов: (i) тщательное управление культурой hiPSC для получения HHOs, (ii) инициирование дифференцировки клеток в 2D и последующий переход к 3D, и (iii) оптимизированная стратегия диссоциации для расщепления HHO на одиночные клетки для секвенирования РНК одиночных клеток. В качестве иллюстрации широкого применения этого подхода данный протокол ранее применялся для раскрытия роли передачи сигналов гормонов щитовидной железы в развитии клеток печени.

Введение

Печень выполняет различные метаболические функции, такие как регулирование доступности легкоусвояемых энергетических субстратов, таких как глюкоза и кетоновые тела, а также детоксикация ксенобиотических соединений. В последние годы наблюдается значительный рост распространенности заболеваний печени, в основном связанных с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ), который при отсутствии лечения может развиться в цирроз или рак1. Поэтому крайне важно понимать метаболические функции печени и связанные с ней заболевания, чтобы способствовать разработке эффективных методов лечения 2,3.

Появление трехмерных (3D) культур привело к созданию модели органоида, представляющей собой революционный и инновационный подход к рассмотрению функциональности и сложности развития органов4. Органоиды определяются как трехмерные самоорганизованные агрегаты дифференцированных клеток, которые имитируют функции и цитоархитегерство соответствующего органа5.

За последние десятилетия мириады протоколов по органоидам печени человека (HHO) приобрели широкий интерес, начиная от использования различных человеческих клеток, полученных из iPSC6, или только гепатоцитоподобныхклеток7, до включения разнообразных сложных микроокружений факторов роста или ингибиторов и дифференцировочных клеток-предшественников в монослое7 или 3D8. Эти подходы позволяют решать множество потенциальных задач, от высокопроизводительного скрининга лекарств9 до получения более глубокого понимания механизмов, лежащих в основе заболеваний печени10.

Здесь выполнен пошаговый протокол дифференцировки HHO на основе химических сигналов, упомянутых11 , с методологически адаптированными вариациями. Этот протокол начинается с надлежащей обработки и культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC), подробно описывая методы манипуляций с гелем внеклеточного матрикса, пассирования клеток и дифференцировки в HHO. Процесс начинается со стимуляции дифференцировки ИПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ)12 и последующего имитации in vivo эффектов FGF и BMP для содействия развитию монослойных клеток задней передней кишки (ПФГ)13. 3D-архитектура достигается на 10-й день, когда клетки ПФГ дифференцируются в незрелую печеночную фазу, которая станет гепатобластами, фетальными клетками-предшественниками холангиоцитов и гепатоцитов2. Наконец, 3D-структуры диссоциируются на отдельные клетки для исследований секвенирования РНК. В качестве примера применимости данного протокола было продемонстрировано, как данная модель HHO подходит для изучения действия гормонов щитовидной железы и дейодиназы 2 типа (D2) на развитие гепатоцитов и холангиоцитов14.

протокол

1. Лечение гипертока крови

ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК (клеточная линия CS03iCTR-n3) были коммерчески закуплены. Надлежащее управление гелевым покрытием внеклеточного матрикса и средой ИПСК является ключом к прикреплению ИПСК к пластинам и их питанию. Здесь были описаны объемы, необходимые для одного 6-луночного планшета. Оставшиеся ИПСК из 6-луночного планшета, которые не будут дифференцироваться в органоиды, могут быть сохранены в жидком азоте для длительного хранения.

  1. Дозирование геля с внеклеточным матриксом и среды hiPSC
    1. Правильно разморозьте флакон геля с внеклеточным матриксом, поместив в емкость со льдом при температуре 4 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выделением квотирования проверьте сертификат анализа, чтобы проверить объем для коэффициента разрежения. Это представляет собой концентрацию белка геля внеклеточного матрикса; Поэтому он варьируется от одного лота к другому.
    2. Распределите гель с внеклеточным матриксом в подходящие аликвоты в соответствии с коэффициентом разбавления (4x, 2x и 1x) с помощью предварительно охлажденных и помеченных пробирок. Добавьте 4-кратный коэффициент разбавления геля внеклеточного матрикса к 25 мл холодного DMEM/F12, чтобы покрыть четыре 6-луночные планшеты. Своевременно запечатайте крышки лабораторной герметизирующей пленкой и заморозьте при температуре -80 °C. Избегайте длительного нахождения на воздухе и образования пузырьков в аликвотах.
    3. Разморозьте 100 мл добавки hiPSC при температуре 4 °C на ночь. Добавьте его в 400 мл базальной среды hiPSC. После гомогенизации с помощью серологической пипетки объемом 50 мл поместите среду hiPSC в пробирки объемом 40 мл и заморозьте при температуре -20 °C до использования.
  2. Покрытие пластинами для культуры hiPSC
    1. Нумеруйте и промаркируйте 6-луночные планшеты. Держите рядом одну гелевую аликвоту внеклеточного матрикса, погруженную в сухой лед.
    2. Для покрытия одного 6-луночного планшета разбавьте одну аликвоту геля внеклеточного матрикса (1x) в 6,25 мл холодного DMEM/F12 (2x в 12,5 мл и 4x в 25 мл DMEM/F12).
    3. Пипеткой введите небольшой объем DMEM/F12 (~500 μл) в гелевую пробирку с внеклеточным матриксом. Поворачивайте вверх и вниз, чтобы разморозить и гомогенизировать гель внеклеточного матрикса холодным DMEM/F12, предотвращая образование пузырьков, и верните его в остальную часть холодной пробирки, содержащей DMEM/F12, с помощью серологической пипетки для полного перемешивания.
    4. Внесите 1 мл геля внеклеточного матрикса в DMEM/F12 в одну лунку для покрытия 6-луночной пластины (6 мл для всей пластины). Равномерно распределите 1 мл по поверхности, перемещая, не встряхивая, пластину до полного ее покрытия.
    5. Дайте постоять при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа перед использованием. Если 6-луночный планшет используется не полностью, закройте его лабораторной герметизирующей пленкой и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелку с покрытием можно хранить в холодильнике в течение 1 недели при температуре 4 °C.
  3. Размораживание и культивирование гиПСК
    1. Заранее рассчитайте объем среды hiPSC и прогрейте при РТ вместе с 6-луночным покрытием планшета за 1 ч до применения (2 мл на лунку).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае холодных или замороженных аликвот погрузите их в инкубатор с температурой 37 °C или водяную баню за 15 минут до использования.
    2. Разделите 1 мл ИПСК в жидкости N2 из криовиала на 3 лунки 6-луночного планшета (соотношение 1:3). Для целого 6-луночного планшета используйте 2 криовалиала. Здесь в протоколе описывается размораживание и культивирование ИПСК из одного криовиала. Повторите процесс для 2 криовалиалов.
    3. Введите криовиал, содержащий примерно 1 мл замороженных ИПСК через колпачок и пропустив его через поверхностную воду, при этом дно флакона погрузить на водяную баню при температуре 37 °C до размораживания.
    4. После размораживания распылите на криовиал этанол и пипеткой нанесите 1 мл ИПСК с пипеткой. Медленно дозируйте в пустую коническую пробирку объемом 15 мл. Добавляйте 5 мл теплой среды hiPSC по каплям, осторожно встряхивая пробирку.
    5. Центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 5 мин при RT. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации стеклянной пипеткой, подключенной к вакууму, не разрушая гранулу, оставляя некоторое количество остаточной среды. Осторожно ресуспендируйте гранулу в 6 мл среды, а затем добавьте по 2 мл на лунку в 3 лунки 6-луночного планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставляйте небольшие скопления иПСК для правильного роста.
    6. Согните 6-луночную пластину и аспирируйте гель внеклеточного матрикса с ранее покрытой пластины, не касаясь кончика до дна лунки.
    7. Переведите 2 мл среды с ИПСК на лунку. Осторожно встряхните пластину вперед, назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить агрегаты hiPSC на пластине.
    8. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%. Ежедневно меняйте среду (2 мл на лунку), проверяя прогрессирующий рост.
    9. Пассаж ИПСК при приобретении 80% слияния роста (через 4-5 дней; см. рисунок 1А). Характеристики здоровых и пролиферативных ИПСК включают четкие границы и плотную упаковку крупных ядер в центре растущих клеточных агрегаций.
  4. Пассирование ИПСК
    1. Как только hiPSCs достигнут 80% конфлюенции, что указывает примерно на 1,2 x 106 клеток на лунку, они проходят в новую 6-луночную пластину. Разделите в соотношении 1:3 (от 1 лунки к 3), или отрегулируйте соотношение (1:4; 1:6) в соответствии с требованиями эксперимента.
    2. Перед сдачей необходимо провести заделку геля из внеклеточного матрикса для соответствующего количества 6-луночных планшетов, как описано в шаге 1.2.
    3. Удалите надосадочную жидкость из каждой лунки и добавьте 2 мл PBS на лунку. Аспирация PBS с последующим добавлением 1 мл отслаивающей среды hiPSC в лунку в течение 1 мин. Затем удалите 1 мл отслаивающей среды с ИПСК.
    4. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 7 минут. Добавьте 1 мл среды hiPSC на лунку. Отделите и соберите путем пипетирования 1 мл среды hiPSC с клетками в пробирку объемом 15 мл.
    5. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при RT. Чтобы поместить клетки в 6-луночный планшет, повторите шаги 1.3.5-1.3.7. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%. Перейдите к шагу 1.5. для замораживания hiPSC при необходимости.
  5. Замораживание hiPSC (по желанию)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ИПСК необходимое, необходимое для продвижения в НО, может привести к образованию остаточных скважин, которые могут храниться в течение длительного времени. Если возникает необходимость в расширении прохода для криовиального хранения, ИПСК могут поддерживаться в течение длительного времени.
    1. Разморозьте необходимый объем криоконсервирующей среды (1 мл на лунку клеток) в лед при температуре 4 °С. Маркировка криопробирок с указанием количества пассажей, даты и клеточной линии. Отсоедините ячейки с помощью отсоединяющей среды hiPSC, как показано на шаге 1.4. в конической пробирке объемом 15 мл.
    2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость, осторожно оставляя клеточную гранулу нетронутой. Предусмотрительно ресуспендировать гранулу в 1 мл холодной криоконсервирующей среды (на лунку), оставив агрегаты hiPSC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если лунки имеют низкую плотность, менее 50% сливаемости, на каждые 2 лунки можно использовать 1 мл среды для криоконсервации.
    3. Перенесите 1 мл среды для криоконсервации с ИПСК в криопробирку. Осторожно взбалтывайте криопробирку, чтобы гомогенизировать содержимое клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы готовите больше пробирок для криоконсервации, оставьте уже подготовленные пробирки во льду.
    4. Поместите пробирки в контейнер для заморозки с контролируемой скоростью при температуре -80 °C на ночь. Перенесите трубки в бак с жидким азотом через 24 часа.

2. Пошаговая дифференциация от ИПСК в печеночные органоиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление реагентов было выполнено и соблюдалось в соответствии с рекомендациями производителя.

  1. 2D-дифференциация от hiPSC до DE (день 0-день 4 (от D-0 до D-4); Рисунок 1В)
    1. После 3 пассажей, если клетки здоровы и растут хорошо и быстро, приступают к дифференцировке ИПСК. Покройте 6-луночный планшет, как описано в шаге 1.2. Чтобы дифференцировать hiPSC и DE, используйте набор DE, следуя инструкциям производителя.
    2. Перед началом дифференцировки культивируют ИПСК в соотношении пассажей 2:1 (из 6 лунок получить 3 для начала дифференцировки) в течение 24 ч до достижения концентрации клеток в лунке, указанной в инструкции к ДЭ.
    3. Выполните дифференциацию в соответствии с протоколом производителя со следующими изменениями.
      1. Увеличьте концентрацию Y-27632, добавляемого в hiPSC, с 10 мкМ до 50 мкМ (за сутки до начала дифференцировки).
      2. Увеличьте дозу диссоциационного реагента на 1,5 мл на лунку, а также объем DMEM/F12 до того же количества на лунку в расчете на реагент диссоциации. Добавьте 1 мл DMEM/F12 (из 1,5) в каждую лунку, и еще 0,5 мл скопируйте в пробирку объемом 15 или 50 мл.
  2. Дифференцировка клеток ДЭ в клетки ПФГ (от D-4 до D-10; Рисунок 1С)
    1. Приготовьте среду PFG (Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку Glutamax, 1x добавку B27, 20 нг/мл BMP4, 10 нг/мл FGF2) для дифференцировки клеток DE за несколько дней до индукции в PFG и храните ее при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: B27 содержит T3 в своем составе. В случае исследования гормонов щитовидной железы (ТГ) с этого момента B27 следует заменить на домашний B2615 , который не содержит TH.
    2. Прогрейте среду PFG (2 мл на лунку) и продвинутый DMEM/F12 при 37 °C в течение 15 мин или RT в течение 1 ч. Наклонитесь над планшетом и аспирируйте среду ДЭ из лунок с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму (или вручную с помощью пипетки Р1000), не царапая клетки.
    3. Добавьте 2 мл теплого усовершенствованного DMEM/F12 на лунку, а затем аспирируйте его. Добавьте 2 мл теплой среды PFG на лунку в 6-луночный планшет. Меняйте средство ежедневно в течение следующих 6 дней.
  3. Индукция из 2D клеток ПФГ в 3D незрелые органоиды печени (IHO; с Д-10 по Д-18)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется около 30 000-35 000 элементов в 30 μл, добавляемых в каждую лунку 96-луночного планшета ULA. Коэффициент прохода составляет 2:1, из 2 лунок (6-луночный планшет) с монослоем дифференцированных клеток ПФГ; он обеспечит полноценную 96-луночную пластину со сверхнизким прикреплением (ULA) (Рисунок 1D).
    1. Перед началом приема 3D органоидов или в более ранние дни предварительно приготовьте среду IHO (Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавка N2, 1x B27, 50 нМ A83-01, 30 мкМ дексаметазон, 5 мкМ CHIR99021, 500 нМ вальпроевая кислота, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 40 нг/мл Jagged-1, 300 нг/мл N-6,20-О-дибутириладенозина 30,50-циклической 35-монофосфатной натриевой соли (dbCAMP), 10 мкМ никотинамида) и хранить его при 4 °С.
    2. Наклейте этикетку на 96-луночную пластину со сверхнизким креплением (ULA). Для отделения клеток ПФГ используйте фермент диссоциации клеток в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Перед использованием нагрейте фермент диссоциации, усовершенствованный DMEM/F12 и PBS до 37 °C. Отсадите и выбросьте среду ПФГ из лунок. Добавьте 2 мл PBS на лунку, затем аспирируйте его.
    4. Добавьте 1,5 мл фермента диссоциации клеток в лунку при температуре 37 °C в течение 7 минут, чтобы отделить клетки от лунки. Не удаляя фермент диссоциации клеток, добавьте 1 мл усовершенствованного DMEM. Соберите все клетки и добавьте их в пробирку объемом 50 мл.
    5. Подсчитайте количество клеток на мл с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра. Центрифугируйте при 150 x g в течение 8 мин.
    6. К грануле добавьте соответствующий объем (3 мл среды IHO для всего 96-луночного планшета ULA) и 1x гель внеклеточного матрикса, чтобы довести до конечного необходимого количества клеток (30 000-35 000 клеток).
    7. Поместите планшет на 96 лунок в инкубатор с температурой до 37 °C, 5%CO2 и влажностью 95%. Через 24 ч (D-11) клетки перегруппируются в круглую форму; добавьте 50 мкл на лунку среды IHO.
    8. На следующий день (D-12) увеличьте до 100 мкл среды IHO на лунку. В D14 удалите ~100-120 мкл из каждой лунки либо с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму, либо с помощью пипетки по одной. Следите за тем, чтобы не допустить аспирации органоидов. Добавьте 100 мкл среды IHO в D-14 и D-16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После D-16, из-за отсутствия движения, появляется чрезмерный рост, который исчезает после D18.
  4. Органоиды гепатобластов (ГБО, от D-18 до D-26)
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе IHO с 96-луночной пластины ULA будут перемещены в 6-луночную пластину ULA. Для 96 IHO, полученных на предыдущей стадии, в каждую скважину было помещено 10 органоидов, что в общей сложности представляет собой 1 и 1/2 6-луночных планшетов ULA для продолжения созревания (Рисунок 1E).
    1. Как и на предыдущих этапах дифференцировки, подготовьте среду для дифференцировки ГБО в предыдущие дни.
      1. Коктейль реагентов, используемых для дифференцировки в ГБО, описан на шаге 2.3. Удалите вальпроевую кислоту и включите в коктейль следующие биохимические вещества: BMP7, BMP4 и FGF7. Окончательный состав представляет собой усовершенствованный DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку N2, 1x B27, 50 нМ A83-01, 30 мкМ Дексаметазон, 5 мкМ CHIR99021, 500 нМ вальпроевую кислоту, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 40 нг/мл Jagged-1, 300 нг/мл N-6,20-O-дибутириладенозин 30,50-циклический 35 монофосфат натрия соль (dbCAMP), 10 мкМ никотинамид, 25 нг/мл FGF7, 50 нг/мл BMP4, 20 нг/мл BMP7.
    2. Предварительно подогрейте HBO medium (3 мл на лунку) и Advanced DMEM/F12 (3 мл на лунку) при 37 °C. Добавьте в каждую лунку по 3 мл теплого усовершенствованного DMEM/F12.
    3. Распределите 10 органоидов IHO в лунку из 96-луночного планшета с наконечником шириной 200 мл. Извлеките усовершенствованный DMEM/F12, наклонившись над пластиной и отсосав его с помощью стеклянной пипетки, подключенной к вакууму (или вручную с помощью P1000).
    4. Добавьте 3 мл теплой среды ГБО на лунку. Включите и поместите 6-луночные планшеты ULA на мультиплатформенный шейкер при 65 об/мин внутри инкубатора, установленного при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%. Через 4 дня (Д-22) и 6 дней (Д-24) замените среду ГБО (3 мл на лунку).
  5. Созревание в печеночные органоиды (ГО) в 2 различные фазы (от D-26 до D-46)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это последний процесс созревания, который происходит в два периода дифференцировки в зависимости от содержания и типа реагентов в среде.
    1. Заранее приготовьте первую среду HO (HO1) и храните ее при температуре 4 °C. Удалите Jagged1 и уменьшите концентрацию CHIR99021 по сравнению со средой HBO. Окончательный состав: Advanced DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x N2 добавка, 1x B27, 500 нМ A83-01, 30 мкМ Дексаметазон, 2 мкМ CHIR99021, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 300 нг/мл N-6,20-О-дибутирилиладенозин 30,50-циклической 35 монофосфатной натриевой соли (dbCAMP), 10 мкМ никотинамида, 25 нг/мл FGF7, 20 нг/мл BMP4, 20 нг/мл BMP7.
    2. Нагрейте среду Advanced DMEM/F12 и HO1 до 37 °C перед использованием. В том же 6-луночном планшете ULA осторожно отсасывайте предыдущую среду HBO, наклонившись над пластиной и поместив кончик стеклянной пипетки, подключенной к вакууму, к стене (или вручную с помощью пипетки P1000).
    3. Добавьте 3 мл теплого Advanced DMEM/F12 на лунку и аспирируйте его. Добавьте 3 мл теплой среды HO1 на лунку. Меняйте среду HO1 каждые 3 дня (D-29, D-32, D-35, D-38) вместе со сбором образца.
    4. На этапе D 38 модифицируйте коктейль реагентов для второго периода HO (HO2), удаляя CHIR99021, BMP4, dbcAMP и FGF7 и заменяя их FGF19 и DAPT. Конечная композиция среды представляет собой усовершенствованный DMEM/F12 в качестве базальной среды, 1x добавку N2, 1x B27, 500 нМ A83-01, 30 мкМ дексаметазона, 50 нг/мл эпидермального фактора роста человека (EGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов человека (HGF), 10 мкМ никотинамида, 20 нг/мл BMP7, 25 нг/мл FGF19, 5 мкМ DAPT.
    5. Нагрейте среду Advanced DMEM/F12 и HO2 до 37 °C перед использованием. Продолжайте с помощью 6-луночного планшета ULA и осторожно аспирируйте предыдущую среду HO1. Добавьте 3 мл Advanced DMEM/F12 в лунку и удалите его.
    6. Добавьте 3 мл теплой среды HO2 на лунку. Меняйте носитель HO2 каждые 4 дня (D-42, D-46, D-50, ...) и отбирайте образцы в те же дни, что и носитель.

3. Диссоциация одиночных клеток

Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для метода секвенирования РНК одиночных клеток. Количество органоидов может варьироваться в зависимости от размера, и чем старше день диссоциации, тем больше количество клеток в органоидах. В прежние времена количество диссоциированных органоидов увеличивалось, а время диссоциации уменьшалось в равных количествах. Диссоциацию проводили с 10 органоидами в D-14 и D-17, 8 органоидами в D-23 и D-26 и 6 органоидами в D-30 и D-45. Процедуры для одного кластера органоидов подробно описаны (рис. 1F).

  1. Приготовление реагентов
    1. Приготовьте Advanced-DMEM с конечной концентрацией 7,5% бычьего альбумина фракции V (BSA) и отфильтруйте после гомогенизации.
    2. Приготовьте 1 мл среды фермента диссоциации с 1 мл трипсина 0,5% - ЭДТА (10х) в качестве базальной среды, 50 мкМ Y-27632, 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы и 1 Ед/мкл ДНКазы I.
    3. Приготовьте среду для инактивации трипсина с 2 мл Advanced DMEM/F12 + 7,5% BSA в качестве базальной среды, 50 мкМ Y-27632, 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы и 1 Ед/мкл ДНКазы I.
    4. Перед началом работы нагрейте фильтрующий материал и PBS до 37 °C.
  2. Диссоциация HHO
    1. Очистите рабочее место и инструменты с помощью очистителя РНКаза. Соберите количество органоидов в соответствии со днем дифференцировки в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с широко открытым наконечником.
    2. Постирайте PBS 2x-3x. Добавьте 1 мл среды диссоциации фермента в пробирку объемом 15 мл с собранными органоидами и выдержите при температуре 37 °C в коромысле при 30 об/мин в течение 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны и не роняйте трубку с коромысла.
    3. Через 5 минут сначала проверьте колпачок на наличие оставшихся органоидов, затем механически разрушьте органоиды с помощью P1000, вращая вверх и вниз 10 раз для каждого органоида (всего 60 раз). Повторите то же самое нарушение с P200. Проверьте крышку трубки на случай, если на ней не застрянут органоиды.
    4. Поместите пробирку объемом 15 мл снова на коромысле в инкубатор еще на 5 минут. Повторите процесс, описанный в пункте 4, начиная с вращения P200 вверх и вниз и продолжая серологической пипеткой объемом 1 мл, подключенной к наконечнику P10.
    5. Снова поместите пробирку объемом 15 мл на коромысле в инкубатор на последние 5 минут. В случае отсутствия диссоциации оставьте еще на 5 минут и повторите ручное прерывание.
    6. Добавьте 1 мл инактивирующей среды трипсина и гомогенизируйте ее. Поместите новую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл с клеточным фильтром 40 μм сверху. Отфильтруйте 2 мл (клетки со средой для диссоциации фермента и средой для инактивации трипсина) через клеточный фильтр 40 мкм в пробирку объемом 15 мл.
    7. Добавьте еще 1 мл инактивирующей среды для трипсина, чтобы извлечь все оставшиеся клетки из клеточного фильтра размером 40 мкм.
    8. Возьмите 5 мкл одноклеточной среды, смешанной с 5 мкл раствора красителя, чтобы подсчитать количество диссоциированных клеток, чтобы приступить к их фиксации. Подсчитайте клетки после центрифугирования и ресуспензии с помощью первого реагента из набора для фиксации и выполните фильтрацию клеток с помощью клеточного фильтра 40 мкм.

Результаты

Каждый этап этого протокола ступенчатой дифференцировки от ИПСК в ГОК определяли с помощью количественных измерений методом количественной ПЦР и иммунофлюоресценции специфичных для стадий маркеров, известных из библиографии (рис. 2). Пошаговая после...

Обсуждение

Текущий протокол предлагает различные методологические детали того, как работать с гиПСК и последующими 3D-культурами органоидов. Это включает в себя два основных критических этапа: (i) отделение двухмерных культур и последующее их развитие в трехмерные органоиды печ?...

Раскрытие информации

Антонио К. Бьянко является консультантом компаний Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. У других авторов нет соответствующих разоблачений.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6462All procedures
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6470All procedures
15 mL Polypropilene Conical TubeFalcon (Corning)352097Dissociation Hepatic Organoids
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6465All procedures
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigmaT2877-100Hepatic Organoid differentiation
40 μm Cell Strainer Corning431750Dissociation Hepatic Organoids
50 mL tube Falcon (Corning)352070All procedures
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo fisher scientific140675hiPSC maintenance
A83-01 R&D Systems2939/10Hepatic Organoid differentiation
Advanced DMEM/F12Gibco12634010Hepatic Organoid differentiation
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsART2069GPKAll procedures
B27 supplement Gibco17504044Hepatic Organoid differentiation
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Gibco15260037Dissociation Hepatic Organoids
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue CultureGoldBioA-421-100Dissociation Hepatic Organoids
CHIR99021R&D Systems4423/10Hepatic Organoid differentiation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Hepatic Organoid differentiation
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Hepatic Organoid differentiation
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell lineCedar-sinaihiPSC maintenance
DAPTR&D Systems2634/10Hepatic Organoid differentiation
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGHepatic Organoid differentiation
DexamethasoneR&D Systems1126/100Hepatic Organoid differentiation
DMEM/F12Gibco11320033hiPSC maintenance
DNAse I, RNase-free, HCThermo Fisher scientificEN0523Dissociation Hepatic Organoids
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357551All procedures
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357543All procedures
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, SterileCorning357550All procedures
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Hepatic Organoid differentiation
Glutamax supplementGibco35050061Hepatic Organoid differentiation
L-ThyroxineSigmaT1775-1GHepatic Organoid differentiation
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mLCorning354277Extracellular matrix gel
mFreSRStemcell Technologies5855hiPSC cryopreservation medium
mTeSR 5x Supplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
Multi Platform Shaker Fisherbrand (Thermo Fisher technologies)88861021Hepatic Organoid differentiation
N2 supplement Gibco17502048Hepatic Organoid differentiation
Nicotinamide R&D Systems4106/50Hepatic Organoid differentiation
PBS, pH 7.4Gibco10010023hiPSC maintenance
Recombinant human BMP4  R&D Systems314-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG-200Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF19R&D Systems959-FG-025/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human HGFR&D Systems294-HG-005/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera R&D Systems1277-JG-050Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CFHepatic Organoid differentiation
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC detaching medium
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μLInvitrogenAM2682Dissociation Hepatic Organoids
RNase ZapInvitrogenAM9780Dissociation Hepatic Organoids
Sorvall  Legend XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004539All procedures
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemcell Technologies5110Hepatic Organoid differentiation
Trypan Blue solution (0.4%) Gibco15250061Dye solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604013Cell Dissociation enzyme
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) Gibco15400054Dissociation Hepatic Organoids
Valproic acid, sodium saltR&D Systems2815/100Hepatic Organoid differentiation
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher scientificM79735QDissociation Hepatic Organoids
Y-27632 dihydrochlorideR&D Systems1254Hepatic Organoid differentiation

Ссылки

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780 (2023).
  15. . B27 Supplement Available from: https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016)
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644 (2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242 (2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208 (2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131 (2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

IPSCHiPSCs3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены