JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает использование векторов аденоассоциированных вирусов (AAV) для клеточно-специфического мечения и визуализации in vivo с помощью конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа (CSLO). Этот метод позволяет исследовать различные типы клеток сетчатки и их вклад в функцию сетчатки и заболевание.

Аннотация

Динамическая природа клеточных процессов сетчатки обуславливает необходимость совершенствования методов доставки генов и мониторинга в реальном времени для улучшения понимания и лечения глазных заболеваний. В этом исследовании представлен оптимизированный подход к аденоассоциированному вирусу (AAV), использующий специфические серотипы и промоторы для достижения оптимальной эффективности трансфекции в целевых клетках сетчатки, включая ганглиозные клетки сетчатки (RGC) и глию Мюллера. Используя точность конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (CSLO), эта работа представляет собой неинвазивный метод визуализации in vivo , который фиксирует продольную экспрессию AAV-опосредованного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Такой подход избавляет от необходимости терминальных процедур, сохраняя непрерывность наблюдения и благополучие испытуемого. Кроме того, сигнал GFP может быть прослежен в инфицированных AAV RGC вдоль зрительного пути к верхнему холмику (SC) и латеральному коленчатому ядру (LGN), что открывает возможности для прямого картирования визуальных путей. Эти результаты представляют собой подробный протокол и демонстрируют применение этого мощного инструмента для изучения в режиме реального времени поведения клеток сетчатки, патогенеза заболевания и эффективности генных терапевтических вмешательств, предлагая ценную информацию о живой сетчатке и ее связях.

Введение

Будучи единственной оптически доступной частью центральной нервной системы, сетчатка служит ценной модельюдля исследований в области нейробиологии. Ганглиозные клетки сетчатки (РГК), выходные нейроны сетчатки, которые передают визуальную информацию в мозг, играют решающую роль в зрительной функции. Их потеря или дисфункция приводит к ухудшению зрения и необратимой слепоте, как это наблюдается при глаукоме и других оптических невропатиях2. Глия Мюллера, основные глиальные клетки сетчатки, необходимы для поддержания гомеостаза сетчатки, обеспечивая структурную и метаболическую поддержку нейронов, регулируя уровень нейротрансмиттеров и способствуя восстановлению и регенерации сетчатки3. Их дисфункция связана с различными заболеваниями сетчатки, включая диабетическую ретинопатию4, возрастную макулярную дегенерацию5 и глазной ишемический синдром6. РГК и глия Мюллера демонстрируют тесное взаимодействие и взаимозависимость; Глия Мюллера оказывает существенную поддержку РГК, в то время как активность РГК может влиять на функцию глии Мюллера 3,7. Изучение как РГК, так и глии Мюллера имеет решающее значение для понимания функции сетчатки и разработки эффективных методов лечения множественных заболеваний сетчатки.

В современных исследованиях сетчатки в основном используются такие методы, как оптическая когерентная томография (ОКТ) для измерения толщины слоя нервных волокон сетчатки или траекторий пучков аксонов 8,9. Хотя эти методы бесценны для выявления потери РГК, они не дают подробного представления о морфологии РГК и глиальных клетках из-за ограниченного разрешения. Аналогичным образом, несмотря на то, что передовые методы, такие как адаптивная оптика, сканирующая лазерная офтальмоскопия (AO-SLO), позволяют визуализировать РГК, фоторецепторы и глиальные клетки в живой сетчатке человека, их техническая сложность и ограниченная доступность ограничивают их использование в основном специализированными исследовательскими условиями. Учитывая эти ограничения, существует постоянная потребность в разработке более доступных и надежных методов углубленного изучения конкретных популяций клеток сетчатки in vivo.

Соответственно, этот протокол направлен на внедрение альтернативного подхода к визуализации, подходящего для исследовательских приложений в клетках сетчатки. Он сочетает в себе возможности AAV-опосредованного мечения по типу клеток с неинвазивным характером визуализации CSLO. Аденоассоциированные вирусы (AAV) являются универсальными векторами доставки генов, известными своей низкой иммуногенностью и способностью трансдуцировать широкий спектр типов клеток, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки11. Это делает их идеальными инструментами для нацеливания на определенные клеточные популяции в сложной среде сетчатки. Используя векторы AAV с тщательно подобранными серотипами и промоторами, можно достичь селективной экспрессии флуоресцентных белков в нескольких типах клеток, представляющих интерес, таких как RGC и глия Мюллера. Например, AAV2 известен своей более высокой эффективностью трансдукции в RGC12,13, в то время как AAV8 заметно эффективен при нацеливании на фоторецепторы14, а AAV9 демонстрирует сильные возможности трансфекции в глии Мюллера15, демонстрируя широкую эффективность в различных слоях клеток сетчатки. Важно отметить, что эффективность AAV зависит не только от выбора серотипа, но и от промоторов, которые диктуют интенсивность и клеточную специфичность экспрессии трансгена, подчеркивая важность тщательного отбора для достижения оптимальной трансдукции.

Для мечения RGC в этом протоколе используется AAV2 с промотором синапсина человека (hSyn). AAV2 демонстрирует эффективную трансдукцию РГК после интравитреального введения13, а промотор hSyn, повсеместно распространенный промотор нейронов, стимулирует сильную и специфическую экспрессию трансгенов в этих клетках16. Для глии Мюллера в протоколе используются векторы AAV9, управляемые промотором17 GfaABC1D, который демонстрирует сильную экспрессию трансгенов в этихклетках 15. Этот подход к таргетной маркировке позволяет исследователям отличать эти клетки от окружающей ткани сетчатки и отслеживать их с течением времени, обеспечивая основу для наблюдения in vivo за клетками сетчатки и их реакцией на изменения биосреды.

Конфокальная сканирующая лазерная офтальмоскопия (CSLO) – это неинвазивный метод визуализации, который позволяет получать изображения живой сетчатки с высоким разрешением, позволяя визуализировать в режиме реального времени популяции флуоресцентно меченых клеток сетчатки 18,19,20. Сфокусированный лазерный луч сканирует сетчатку, улавливая излучаемый свет, проходящий через отверстие, чтобы устранить расфокусированные сигналы, что приводит к получению более четких изображений с повышенной контрастностью. В этом протоколе используется система Heidelberg Spectralis CSLO, которая широко используется для визуализации клеток сетчатки у живых животных, включая исследования визуализации меченых трансгенами RGC21,22 и микроглии23. Используя установку HRA CSLO с лазером 488 нм и соответствующими фильтрами, исследователи могут визуализировать флуоресцентно меченные RGC или глию Мюллера у живых животных после интравитреального введения векторов AAV, несущих флуоресцентные репортерные гены. Протокол продольной визуализации с еженедельными сеансами, охватывающими как центральную, так и периферическую сетчатку, отслеживает изменения с течением времени. Чтобы уделять приоритетное внимание благополучию животных, в протоколе используется автоматическая система отслеживания взгляда (ART) отделения HRA CSLO, позволяющая точно получать изображения без необходимости общей анестезии или контактных линз.

Этот протокол использует объединенную мощь AAV и CSLO для обеспечения продольного мониторинга определенных типов клеток сетчатки in vivo. Сочетая специфичность типа клеток AAV-опосредованного мечения с неинвазивными возможностями визуализации CSLO с высоким разрешением, этот метод позволяет исследователям изучать динамические изменения в RGC и глии Мюллера в ответ на различные стимулы или вмешательства. Эти выводы обладают значительным потенциалом для разработки новых диагностических и терапевтических стратегий лечения заболеваний сетчатки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Столичного медицинского университета в Пекине. Четырехнедельные взрослые самцы мышей C57BL/6J (весом от 15 до 20 г) использовались для всех экспериментов и содержались в помещениях с контролируемой температурой и 12-часовым циклом свет/темнота. Стандартная еда для грызунов и вода были доступны в неограниченном количестве. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Трансфекция AAV-опосредованных клеток сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для целенаправленной трансдукции РГК в этом протоколе используется AAV2-hSyn-eGFP, который включает в себя промотор hSyn для обеспечения надежной экспрессии усиленного GFP. Мюллеровская глия нацелена с помощью AAV9-GfaABC1D-eGFP. Для достижения оптимальной эффективности трансдукции и устойчивой экспрессии трансгенов для интравитреальных инъекций мышам13 рекомендуется минимальный титр AAV 1 x 1012 вирусных геномов (vg)/мл.

  1. Придерживайтесь строгих протоколов безопасности при проведении процедур трансфекции клеток сетчатки с помощью AAV, чтобы предотвратить случайное воздействие и обеспечить безопасную рабочую среду.
  2. Выполняйте все процедуры с вирусными векторами в сертифицированном кабинете биобезопасности (БСК). Снабдите персонал соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз, на протяжении всей процедуры.
  3. Утилизируйте все острые предметы и биологически опасные материалы надлежащим образом в соответствии с протоколами безопасности учреждения для соблюдения требований и защиты всего персонала лаборатории.

2. Получение вирусных векторов и животных

  1. Получите векторы AAV2-hSyn-eGFP или векторы AAV9-GfaABC1D-eGFP, хранящиеся при температуре -80 °C. Размораживайте векторы на льду непосредственно перед использованием, чтобы сохранить вирусную целостность.
  2. Обезболивайте мышей внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия в дозировке 50 мг/кг. Подтвердите глубину анестезии, проверив рефлексы задней стопы перед дальнейшими действиями.
  3. Подстригите усы, чтобы предотвратить вмешательство в операционную область во время процедуры. Продезинфицируйте глазницу 20% раствором повидон-йода в течение 2 с, затем тщательно промойте стерильным физиологическим раствором.
  4. Нанесите каплю 0,5% пропаракаина местно, чтобы свести к минимуму дискомфорт и предотвратить непроизвольные движения глаз.

3. Обработка и интравитреальное введение вирусных векторов

  1. Перенесите 1 мкл выбранного раствора AAV (AAV2-hSyn-eGFP или AAV9-GfaABC1D-eGFP) на кусок чистой, предварительно охлажденной парафиновой пленки, чтобы избежать колебаний температуры, которые могут повлиять на активность вируса.
  2. Аспирируйте раствор AAV с помощью стеклянного шприца Hamilton со скошенной иглой 33 G под офтальмологическим хирургическим микроскопом.
  3. Поместите мышь в брюшное лежачее положение под микроскопом. Слегка наклоните голову, чтобы приподнять глазную сторону, предназначенную для инъекции. Отрегулируйте и оптимизируйте увеличение микроскопа, чтобы четко определить верхнюю область орбиты мыши.
  4. Введите иглу на 1-2 мм позади лимба у верхнего склерального края глаза в полость стекловидного тела. Вводите растворы AAV медленно, чтобы избежать обратного потока или повреждений, вызванных давлением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение места инъекции: Выполняйте инъекцию в верхний височный квадрант глаза, примерно на 1 мм позади лимба. Выбирайте это место, чтобы избежать крупных кровеносных сосудов и свести к минимуму риск повреждения хрусталика. Избегайте мест инъекций слишком близко к лимбу, чтобы предотвратить проникновение радужной оболочки или истирание хрусталика. Избегание сосудистой сети: Используйте операционный микроскоп для тщательного осмотра запланированного места инъекции на предмет видимых кровеносных сосудов перед инъекцией. Если присутствуют сосуды, немного отрегулируйте точку входа, чтобы избежать их. Вводите иглу под небольшим углом, параллельно радужной оболочке, чтобы еще больше снизить риск повреждения сосудов. Избегайте повторных инъекций в одну и ту же область, чтобы снизить риск субретинального кровоизлияния.
  5. Удерживайте иглу на месте в течение 30 секунд, чтобы векторы рассеялись в камере стекловидного тела и осядли на поверхности сетчатки, тем самым максимизируя шансы на успешную трансдукцию.
  6. Медленно извлекайте иглу, чтобы свести к минимуму риск обратного кровотока стекловидного тела.
  7. Нанесите мазь с антибиотиком местного действия на место инъекции сразу после инъекции. Следите за тем, чтобы мазь наносилась равномерно, чтобы полностью покрыть поверхность глаза, предотвращая глазную инфекцию и воспаление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мазь с антибиотиком содержит 1 мг/г дексаметазона, 3500 МЕ/г сульфата неомицина и 6000 МЕ/г полимиксина B сульфата.
  8. Поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела во время восстановления после анестезии, и внимательно следите за ними на предмет любых признаков дистресса или отклонений. После полного выздоровления и отсутствия осложнений верните их в клетки с доступом к обычной пище и воде.

4. Визуализация in vivo с помощью CSLO

  1. Подготовка животных
    1. Выберите мышь, инфицированную AAV2-hSyn-eGFP или AAV9-GfaABC1D-eGFP после 4 недель интравитреального введения. Нанесите на поверхность глаза одну каплю глазного раствора, содержащего 0,5% тропикамида и 0,5% фенилэфрина, чтобы расширить зрачок примерно до 22 мм в диаметре.
      Примечание: Для оптимального флуоресцентного мечения клеток сетчатки после интравитреального введения рекомендуется интервал времени не менее 4 недель для трансдукции AAV. Кроме того, в наших экспериментах по раздавливанию зрительного нерва (ONC) сетчатка была визуализирована через 4 недели после инфекции, а также на 7 и 14 день после травмы. Эти временные точки были выбраны для того, чтобы зафиксировать как первоначальную экспрессию AAV, так и прогрессирование изменений сетчатки после ОНЦ.
    2. Накройте платформу для визуализации куском чистой прокладки, чтобы избежать возможного загрязнения экскрементов животных в процессе работы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанная платформа визуализации обеспечивает достаточно места для лежания животного, обеспечивая устойчивость и минимизируя движения во время ручного удержания для оптимального получения изображения.
    3. Осторожно перенесите мышь на платформу для визуализации и дайте период акклиматизации в течение 2-5 минут перед визуализацией, чтобы свести к минимуму стресс и облегчить адаптацию к среде визуализации.
    4. С помощью второго техника мягко удерживайте животное, сохраняя при этом сознательное состояние на протяжении всей процедуры. Обеспечьте 10-секундный интервал отдыха после 15 секунд визуализации, чтобы можно было моргать глазами и поддерживать влажность роговицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно потрите кожу головы, чтобы вызвать спонтанное поднятие век, избегая использования принудительного ограничения век или дополнительных приспособлений, таких как зажимы, тем самым снижая риск травмы глаз. Общая анестезия не используется для сохранения оптической прозрачности во время длительных сеансов визуализации, так как она может усугубить переходное помутнение хрусталика. Обеспечьте баланс между получением высококачественного изображения и комфортом и безопасностью животного на протяжении всей процедуры. Завершите всю процедуру в течение 5 минут, чтобы обеспечить благополучие животного и поддерживать качество визуализации.
    5. Отрегулируйте положение головы и выровняйте объектив камеры, точно настроив ручку фокусировки (рис. 1B) и микроманипулятор (рис. 1C), чтобы нацелить область интереса (ROI) для последующей визуализации in vivo .
  2. Конфигурация системы
    1. Прикрепите бесконтактный широкоугольный объектив с углом обзора 55° к камере, чтобы расширить поле зрения области глазного дна.
    2. Установите колесо фильтров в положение A (ангиография), чтобы обеспечить возможность получения инфракрасного (ИК) и флуоресцентного ангиографического (ФА) режимов визуализации (Рисунок 1A). Включите лазер и источник питания, чтобы активировать систему визуализации CSLO.
    3. Откройте программное обеспечение Heidelberg Eye Explorer и создайте новое обследование, нажав на значок «Новый пациент » в верхней части строки меню. Введите соответствующую информацию о животном и примите кривизну роговицы по умолчанию 7,7 мм во всплывающем окне.
    4. Выберите желтую кнопку «Пуск » (рисунок 1E) на экране панели управления, чтобы начать режим обработки изображений в реальном времени.
  3. Визуализация in vivo CSLO
    1. Выберите на панели управления ИК-режим (рис. 1G) с автофлуоресценцией на длине волны возбуждения 820 нм. Для получения изображений с высоким разрешением технология High Res. (HR) активируется либо через оконный интерфейс, либо через ручную панель управления (рис. 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасная визуализация (ИК) обычно является первым шагом в офтальмологической визуализации CLSO, полученной до флуоресцентной ангиографии (ФА), для получения исходного изображения. Равномерное освещение, минимальные артефакты и четкая фокусировка на основных сосудах сетчатки имеют решающее значение для надежности фокусировки в z-плоскости и получения высококачественных ИК-изображений.
    2. Переместите линзу по направлению к глазу мыши с помощью джойстика с микроманипулятором XYZ для точной настройки. Изучите оптическую прозрачность и поверните ручку чувствительности (Рисунок 1D) против часовой стрелки, чтобы уменьшить яркость изображения глазного дна до 40%-60%, тем самым избегая передержки глазного дна и улучшая визуализацию деталей сетчатки.
    3. Отрегулируйте ручку фокусировки и микроманипулятор до тех пор, пока на глазном дне не будут однозначно идентифицированы диск зрительного нерва и сосуды сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии оптимальной фокальной плоскости: (1) Равномерно освещенный вид глазного дна без темных углов. (2) Равномерное освещение вокруг диска зрительного нерва без очаговых темных пятен или искажений. (3) Четкая форма просвета крупных сосудов сетчатки с видимым движением кровотока.
    4. Переключитесь в режим FA (рисунок 1H) с помощью твердотельного синего лазера на длине волны возбуждения 488 нм и барьерного фильтра на длине волны 500 нм. Поверните ручку чувствительности (Рисунок 1D) по часовой стрелке, чтобы увеличить яркость изображения глазного дна до 50%-107% для освещения целевой области сетчатки.
    5. Установите среднее значение ART (синяя полоса в левом нижнем углу интерфейса программного обеспечения) как минимум 15, чтобы улучшить отношение сигнал/шум. Эта функция усредняет серию B-сканов, полученных в одном и том же месте, улучшая качество изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя более высокое значение усреднения ART обычно улучшает качество изображения за счет усреднения, оно также увеличивает продолжительность сканирования. Такая продолжительность может потенциально увеличить риск обезвоживания роговицы и усталости животных, факторы, которые необходимо тщательно учитывать, особенно при визуализации животных в сознании.
    6. Выровняйте по внутренней плоскости сетчатки, целенаправленно нацеливаясь на GFP, экспрессирующие RGC или глиальные клетки Мюллера. Тонкая регулировка производится для обеспечения четкого освещения желаемой популяции клеток, такой как сома и аксоны RGC или тело клетки Мюллера. Чувствительность визуализации сбалансирована для достижения оптимальной визуализации и предотвращения перенасыщения GFP-положительных клеток.
      Примечание: Для получения изображений с сопоставимой четкостью и яркостью сигнала GFP регистрация чувствительности должна быть постоянной для всех мышей в эксперименте.
    7. Нажмите ручку чувствительности (Рисунок 1D), чтобы запустить режим ART, который генерирует живое среднее изображение в режиме онлайн. Подождите, пока синяя полоса (представляющая среднее значение ART) в левом нижнем углу интерфейса программного обеспечения достигнет установленного значения ART (≥ 20 кадров), и нажмите кнопку «Получить» на интерфейсе управления, чтобы сделать снимок глазного дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме ART встроено отслеживание движения глаз для автоматической компенсации незначительных движений глаз во время визуализации in vivo , что обеспечивает постоянную фокусировку на выбранной фокальной плоскости сетчатки.
    8. После получения желаемых изображений выйдите из режима ART, нажав ручку чувствительности на сенсорной панели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить высыхание роговицы и обеспечить спонтанное моргание глаз, каждые 15 секунд в процессе визуализации были сделаны 10-секундные перерывы.
    9. Чтобы перемещаться по носовой и височной областям сетчатки, перемещайте головку камеры горизонтально, наблюдая за изображением в реальном времени на экране. Как только целевая область будет достигнута, выполните точную настройку фокусировки и начните процесс визуализации, как описано в шагах 2.3.1-2.3.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте медленные и контролируемые движения камеры, обеспечивая при этом равномерное и яркое освещение глазного дна. Если появляются темные участки, используйте микроманипулятор, чтобы отрегулировать положение камеры по вертикали и повторно центрировать сетчатку.
    10. Чтобы получить изображение верхней сетчатки, аккуратно отрегулируйте положение головы мыши в положение лицевой стороной вверх. Умеренно наклоните головку камеры вверх, чтобы выровнять верхнюю область сетчатки. При необходимости снова отрегулируйте фокус и продолжайте съемку.
    11. По завершении визуализации, все желаемые области сетчатки выходят из окна съемки, а изображения автоматически сохраняются. Нанесите местную смазку на визуализируемый глаз для поддержания увлажнения роговицы.
    12. Чтобы начать осмотр контралатерального глаза, переместите животное на противоположную сторону платформы и повторите шаги 2.3.1-2.3.11.

5. Обработка и анализ изображений

  1. Экспорт и подготовка изображений
    1. Откройте программное обеспечение Heidelberg Eye Explorer и выберите нужный сеанс визуализации CSLO с хорошим качеством. Выбирайте одно или последовательное изображение одного и того же положения сетчатки с постоянными настройками чувствительности в течение определенного времени.
    2. Исключите размытые изображения с плохой фокусировкой или четкостью роговицы, гарантируя, что для анализа будут использоваться только изображения с четкой визуализацией структур сетчатки. Экспортируйте эти изображения в формат TIFF для дальнейшей обработки.
  2. Выравнивание и обрезка изображений
    1. Группируйте изображения для каждого глаза мыши на основе одной и той же области сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные изображения, полученные из системы CSLO, сохраняются в следующем формате: TIFF с размером 1536 x 1536 пикселей, разрешением 5,69 мкм/пиксель и значением ART ≥15.
    2. Для последующих обследований импортируйте изображения в подходящее программное обеспечение для обработки изображений. Поворачивайте и выравнивайте изображения по мере необходимости, чтобы они соответствовали ориентации базового изображения. При сохранении или экспорте обработанных изображений используйте настройки, которые поддерживают максимально возможное качество изображения, чтобы свести к минимуму потенциальные артефакты сжатия.
    3. Выровняйте изображения CSLO из временного ряда одного и того же глаза, повернув их в соответствии с соответствующим базовым изображением, используя сосудистую сеть и диск зрительного нерва в качестве ориентиров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно изучите каждое выровненное изображение, и прежде чем приступать к кадрированию, убедитесь, что оно соответствует следующим критериям: (1) Полный захват области сетчатки: изображение должно полностью охватывать предполагаемую область сетчатки, включая ключевые ориентиры, такие как диск зрительного нерва и основные кровеносные сосуды; (2) Отсутствие артефактов движения: изображение должно быть без размытия, полос или дублирования структур, вызванных движением глаз во время визуализации; (3) Минимальное искажение: изображение должно точно отображать структуру сетчатки без деформации, растяжения или артефактов сжатия, которые могут возникнуть из-за углов изображения или эффектов линзы. (4) Баланс показателей качества изображения: оценка уровней фонового шума (стандартное отклонение интенсивности пикселей в областях без структуры < 5 (масштаб 0-255)); отношение сигнал/шум (SNR >20), постоянство освещения (коэффициент вариации между шестью квадрантами изображения <10%) и однородность изображения (коэффициент вариации в однородных областях <15%).
    4. Выделите повернутое изображение и экспортируйте его в формат TIFF. Для каждой временной точки используйте инструмент обрезки, чтобы случайным образом выбрать и обрезать 5–10 областей (300 x 300 пикселей каждая), содержащих GFP-положительные ячейки, из изображений с одобренным качеством. Экспортируйте каждое обрезанное изображение по отдельности в формат TIFF для дальнейшего анализа.
  3. Измерение интенсивности флуоресценции
    1. Откройте обрезанные изображения CSLO (8-битные оттенки серого, 300 x 300 пикселей) в ImageJ/Fiji.
    2. Чтобы изучить общие изменения флуоресцентных сигналов, измерьте общую интенсивность флуоресценции для каждого обрезанного изображения с помощью функции «Анализ > измерение » (или Ctrl + M). Запишите значение «Среднее», представляющее среднюю интенсивность флуоресценции GFP всего обрезанного изображения.
  4. Количественная оценка RGC
    1. В ImageJ/Fiji отрегулируйте порог интенсивности обрезанных изображений CSLO с помощью Image > Adjust > Brightness/Contrast, чтобы добиться оптимальной визуализации отдельных белых тел сомы на черном фоне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите индивидуальный порог после просмотра партии обрезанных изображений или примените последовательный алгоритм порогового значения (например, метод5 Хуанга в ImageJ/Fiji). Для метода Хуанга: (1) Преобразуйте изображения в 8-битные оттенки серого (Image > Type > 8-bit). (2) Откройте инструмент порогового значения (Изображение > Настроить > порог). (3) Выберите Хуан в качестве метода порогового значения. (4) Просмотрите сегментацию и нажмите « Применить». Порог будет автоматически рассчитан и отображен на гистограмме изображения.
    2. Активируйте плагин Cell Counter и нажмите на каждую GFP-положительную RGC soma для подсчета. Запишите общее количество помеченных ячеек в анализируемой области. Повторите этот процесс для всех обрезанных изображений с каждой последующей временной точки.
  5. Анализ данных
    1. Экспортируйте данные о количестве клеток и интенсивности флуоресценции в электронную таблицу или статистическое программное обеспечение (например, GraphPad Prism).
    2. Проведение соответствующих статистических тестов на основе соответствующего плана эксперимента и гипотез. Интерпретируйте результаты и сделайте вывод.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В соответствии с представленным протоколом различные клетки сетчатки были успешно визуализированы и отслежены in vivo с использованием комбинации AAV-опосредованной доставки генов и CSLO. AAV2-hSyn-eGFP эффективно трансдуцирует RGC, что приводит к устойчивой экспрессии eGFP п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленный протокол подробно описывает надежный и доступный метод эпиднадзора in vivo за конкретными популяциями клеток сетчатки, использующий возможности как AAV-опосредованной доставки генов, так и визуализации CSLO. Этот подход имеет ряд преимуществ по сравне...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (82130029). Рисунок 2A и рисунок 4A были созданы с помощью BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
33 Gauge NeedleHamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05For intravitreal injection
0.5% proparacaine Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaVirus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaVirus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL 
BetadineHealthy medical company001651Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301AFor eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forcepsFST51-AGT5385For optic nerve crush
Graphpad prismGraphPad Prism, USAGraph drawing and statistical analysis
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/FijiNational Institutes of Health, USAImage processing
Maxitrol antibiotic ointmentAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631Topical antibiotics
Microliter SyringeHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solutionSanten Pharmaceutical Co.,Ltd, JapanPupil dilation
Ophthalmic surgical microscope Leica AG, Heerbrugg, SwitzerlandM220For surgical operations
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USAImage alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, GermanyTopical lubricant 

Ссылки

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vivoM 1 4ller

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены