Разработка и применение рапамицин-регулируемых тирозинфосфатаз

Резюме

В этом протоколе описывается разработка, создание и применение рапамицин-регулируемых фосфатаз. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках.

Аннотация

Тирозинфосфатазы являются важным семейством ферментов, которые регулируют важнейшие физиологические функции. Они часто нарушают регуляцию при заболеваниях человека, что делает их ключевыми объектами биологических исследований. Инструменты, которые позволяют регулировать активность фосфатазы, играют важную роль в препарировании их функции. Традиционные подходы, такие как сверхэкспрессия конститутивно активных или доминантных негативных мутантов или подавление с помощью миРНК, не имеют временного контроля. Ингибиторы фосфатазы часто имеют низкую специфичность, и они позволяют исследователям лишь определить, на какие процессы влияет ингибирование фосфатазы.

Мы разработали хемогенетический подход, систему Rapamycin-регулируемую (RapR), которая позволяет осуществлять аллостерическую регуляцию каталитического домена фосфатазы, что обеспечивает жесткий временной контроль активации фосфатазы. Система RapR состоит из домена iFKBP, вставленного в аллостерический сайт в фосфатазе. Внутренняя структурная динамика домена RapR нарушает каталитический домен, что приводит к инактивации фермента. Добавление рапамицина опосредует образование комплекса между iFKBP и коэкспрессируемым белком FRB, который стабилизирует iFKBP и восстанавливает активность каталитического домена фосфатазы.

Эта система обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках. Уникальные возможности этой системы позволяют идентифицировать переходные процессы и исследовать отдельные сигнальные пути после фосфатазы. В этом протоколе описываются рекомендации по разработке RapR-фосфатазы, ее биохимической характеристике и анализу ее влияния на нисходящую передачу сигналов и регуляцию клеточной морфодинамики. В нем также содержится подробное описание стратегии белковой инженерии, анализы in vitro , анализирующие активность фосфатазы, и эксперименты по визуализации живых клеток, выявляющие изменения в морфологии клеток.

Введение

Протеинтирозинфосфатазы представляют собой важнейшее семейство белков, участвующих во множестве клеточных сигнальных событий. Было показано, что они играют ключевую роль в регуляции пролиферации клеток, миграции и апоптоза ^1,2,3. Следовательно, нарушение регуляции протеинтирозинфосфатаз приводит к различным изнурительным заболеваниям и расстройствам 4,5,6,7. Изучение физиологической функции тирозинфосфатаз и их роли....

протокол

1. Дизайн RapR-фосфатаз

1. Планирование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя RapR-Shp2 в качестве примера, этот протокол подробно описывает важные шаги по созданию рапамицин-регулируемой тирозинфосфатазы. Описанный протокол оптимизирован для Shp2, и могут потребоваться дополнительные модификации для адаптации к специфическим свойствам отдельных фосфатаз.
   1. Чтобы гарантировать, что каталитическая активность Shp2 контролируется исключительно рапамицином, а не эндогенными механизмами, вводят мутацию в фосфатазу, чтобы удерживать ее в конститутивно активной конформации. В случае Shp2 введите мутацию D61A.
      Примечание: Е....

Результаты

На рисунке 4 представлены результаты, которые можно ожидать от анализа активности фосфатазы на основе паксиллина. В этом эксперименте конститутивно активная и доминантная отрицательная активность Shp2-фосфатазы сравнивалась с активной и неактивной ак.......

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны этапы разработки, определения характеристик и применения хемогенетически контролируемых фосфатаз. Инструмент RapR-Shp2 основан на регулируемом рапамицином переключателе, вставленном в каталитический домен Shp2. Сильной стороной этого с.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690