Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом протоколе описывается разработка, создание и применение рапамицин-регулируемых фосфатаз. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках.
Тирозинфосфатазы являются важным семейством ферментов, которые регулируют важнейшие физиологические функции. Они часто нарушают регуляцию при заболеваниях человека, что делает их ключевыми объектами биологических исследований. Инструменты, которые позволяют регулировать активность фосфатазы, играют важную роль в препарировании их функции. Традиционные подходы, такие как сверхэкспрессия конститутивно активных или доминантных негативных мутантов или подавление с помощью миРНК, не имеют временного контроля. Ингибиторы фосфатазы часто имеют низкую специфичность, и они позволяют исследователям лишь определить, на какие процессы влияет ингибирование фосфатазы.
Мы разработали хемогенетический подход, систему Rapamycin-регулируемую (RapR), которая позволяет осуществлять аллостерическую регуляцию каталитического домена фосфатазы, что обеспечивает жесткий временной контроль активации фосфатазы. Система RapR состоит из домена iFKBP, вставленного в аллостерический сайт в фосфатазе. Внутренняя структурная динамика домена RapR нарушает каталитический домен, что приводит к инактивации фермента. Добавление рапамицина опосредует образование комплекса между iFKBP и коэкспрессируемым белком FRB, который стабилизирует iFKBP и восстанавливает активность каталитического домена фосфатазы.
Эта система обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках. Уникальные возможности этой системы позволяют идентифицировать переходные процессы и исследовать отдельные сигнальные пути после фосфатазы. В этом протоколе описываются рекомендации по разработке RapR-фосфатазы, ее биохимической характеристике и анализу ее влияния на нисходящую передачу сигналов и регуляцию клеточной морфодинамики. В нем также содержится подробное описание стратегии белковой инженерии, анализы in vitro , анализирующие активность фосфатазы, и эксперименты по визуализации живых клеток, выявляющие изменения в морфологии клеток.
Протеинтирозинфосфатазы представляют собой важнейшее семейство белков, участвующих во множестве клеточных сигнальных событий. Было показано, что они играют ключевую роль в регуляции пролиферации клеток, миграции и апоптоза 1,2,3. Следовательно, нарушение регуляции протеинтирозинфосфатаз приводит к различным изнурительным заболеваниям и расстройствам 4,5,6,7. Изучение физиологической функции тирозинфосфатаз и их роли....
1. Дизайн RapR-фосфатаз
На рисунке 4 представлены результаты, которые можно ожидать от анализа активности фосфатазы на основе паксиллина. В этом эксперименте конститутивно активная и доминантная отрицательная активность Shp2-фосфатазы сравнивалась с активной и неактивной ак.......
В этом протоколе подробно описаны этапы разработки, определения характеристик и применения хемогенетически контролируемых фосфатаз. Инструмент RapR-Shp2 основан на регулируемом рапамицином переключателе, вставленном в каталитический домен Shp2. Сильной стороной этого с.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Авторы выражают признательность доктору Джордан Фаузер за ее вклад в разработку RapR-Shp2 и связанных с ним протоколов. Работа была поддержана премией 5R35GM145318 от NIGMS, премией R33CA258012 от NCI и премией P01HL151327 от NHLBI.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0715 | |
1.5 mL Tubes | USA Scientific | cc7682-3394 | |
2x Laemmli Buffer | For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8 | ||
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 4561096 | |
5x Phusion Plus Buffer | Thermo Scientific | F538L | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Agarsose | GoldBiotech | A-201 | |
Attofluor Cell Chamber | invitrogen | A7816 | |
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-products | 100-106 | Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered |
Brig 35,30 w/v % | Acros | 329581000 | |
BSA | GoldBiotech | A-420 | |
CellGeo | N/A | N/A | Published in 10.1083/jcb.201306067 |
CellMask Deep Red plasma membrane dye | invitrogen | c10046 | |
Colony Screen MasterMix | Genesee | 42-138 | |
DH5a competent cells | NEB | C2987H | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
DMSO | Thermo Scientific | F-515 | |
DNA Ladder | GoldBio | D010-500 | |
dNTPs | NEB | N04475 | |
DpnI Enzyme | NEB | R01765 | |
DTT | GoldBio | DTT10 | DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents |
EGTA | Acros | 409910250 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | |
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | transfection reagent |
Gel extraction Kit | Thermo Scientific | K0692 | GeneJET Gel Extraction Kit |
Gel Green Nucleic Acid Stain | GoldBio | G-740-500 | |
Gel Loading Dye Purple 6x | NEB | B7024A | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l (100x) 100 mL |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-11268 | |
HeLa Cells | ATCC | CRM-CCL-2 | |
HEPES | Fischer | BP310-500 | |
ImageJ Processing Software | N/A | N/A | |
Igepal CA-630 (NP40) | Sigma | I3021 | |
Imidazole Buffer | 25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT | ||
KCl | Sigma | P-4504 | |
L-15 1x | Corning | 10-045-CV | |
LB Agar | Fisher | BP1425-2 | |
Lysis Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
MATLAB | MathWorks | N/A | R 2022b update was used to run CellGeo functions |
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software | N/A | N/A | |
MgCl2 | Fisher Chemical | M33-500 | |
Mineral Oil | Sigma | M5310 | |
MiniPrep Kit | Gene Choice | 96-308 | |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well | Bio-Rad | 4561085 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CV | |
Multiband Polychroic Mirror | Chroma Technology | 89903BS | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-3 | |
Olympus UPlanSAPO 40x objective | Olympus | N/A | |
PBS w/o Ca and Mg | Corning | 21-031-CV | |
PCR Tubes | labForce | 1149Z65 | 0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps |
Phusion Plus DNA Polymerase | Thermo Scientific | F630S | |
Primers | IDT | ||
Protein-G Sepharose | Millipore | 16-266 | |
PVDF Membranes | BioRad | 1620219 | Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches |
Rapamycin | Fisher | AAJ62473MF | |
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium | Corning | 25-053-CI | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x | Fischer | BP1332-1 | for electrophoresis |
Wash Buffer | 20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40 | ||
β-Mercaptoethanol | Fisher Chemical | O3446I-100 | |
Antibodies | |||
Anti-EGFR Antibody | Cell Signaling | 2232 | |
Anti-Erk 1/2 Antibody | Cell Signaling | 9102 | |
Anti-Flag Antibody | Millipore-Sigma | F3165 | |
Anti-GAPDH Antibody | invitrogen | AM4300 | |
Anti-GFP Antibody | Clontech | 632380 | |
Anti-mCherry Antibody | invitrogen | M11217 | |
Anti-paxillin Antibody | Thermo Fischer | BDB612405 | |
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody | Cell Signaling | 2235 | |
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody | Cell Signaling | 9101 | |
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody | Millipore-Sigma | 05-1143 | |
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody | Cell Signaling | 14008 | |
Anti-PLCγ Antibody | Cell Signaling | 5690 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены