Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается разработка, создание и применение рапамицин-регулируемых фосфатаз. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках.

Аннотация

Тирозинфосфатазы являются важным семейством ферментов, которые регулируют важнейшие физиологические функции. Они часто нарушают регуляцию при заболеваниях человека, что делает их ключевыми объектами биологических исследований. Инструменты, которые позволяют регулировать активность фосфатазы, играют важную роль в препарировании их функции. Традиционные подходы, такие как сверхэкспрессия конститутивно активных или доминантных негативных мутантов или подавление с помощью миРНК, не имеют временного контроля. Ингибиторы фосфатазы часто имеют низкую специфичность, и они позволяют исследователям лишь определить, на какие процессы влияет ингибирование фосфатазы.

Мы разработали хемогенетический подход, систему Rapamycin-регулируемую (RapR), которая позволяет осуществлять аллостерическую регуляцию каталитического домена фосфатазы, что обеспечивает жесткий временной контроль активации фосфатазы. Система RapR состоит из домена iFKBP, вставленного в аллостерический сайт в фосфатазе. Внутренняя структурная динамика домена RapR нарушает каталитический домен, что приводит к инактивации фермента. Добавление рапамицина опосредует образование комплекса между iFKBP и коэкспрессируемым белком FRB, который стабилизирует iFKBP и восстанавливает активность каталитического домена фосфатазы.

Эта система обеспечивает высокую специфичность и жесткий временной контроль активации фосфатазы в живых клетках. Уникальные возможности этой системы позволяют идентифицировать переходные процессы и исследовать отдельные сигнальные пути после фосфатазы. В этом протоколе описываются рекомендации по разработке RapR-фосфатазы, ее биохимической характеристике и анализу ее влияния на нисходящую передачу сигналов и регуляцию клеточной морфодинамики. В нем также содержится подробное описание стратегии белковой инженерии, анализы in vitro , анализирующие активность фосфатазы, и эксперименты по визуализации живых клеток, выявляющие изменения в морфологии клеток.

Введение

Протеинтирозинфосфатазы представляют собой важнейшее семейство белков, участвующих во множестве клеточных сигнальных событий. Было показано, что они играют ключевую роль в регуляции пролиферации клеток, миграции и апоптоза 1,2,3. Следовательно, нарушение регуляции протеинтирозинфосфатаз приводит к различным изнурительным заболеваниям и расстройствам 4,5,6,7. Изучение физиологической функции тирозинфосфатаз и их роли....

протокол

1. Дизайн RapR-фосфатаз

  1. Планирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя RapR-Shp2 в качестве примера, этот протокол подробно описывает важные шаги по созданию рапамицин-регулируемой тирозинфосфатазы. Описанный протокол оптимизирован для Shp2, и могут потребоваться дополнительные модификации для адаптации к специфическим свойствам отдельных фосфатаз.
    1. Чтобы гарантировать, что каталитическая активность Shp2 контролируется исключительно рапамицином, а не эндогенными механизмами, вводят мутацию в фосфатазу, чтобы удерживать ее в конститутивно активной конформации. В случае Shp2 введите мутацию D61A.
      Примечание: Е....

Результаты

На рисунке 4 представлены результаты, которые можно ожидать от анализа активности фосфатазы на основе паксиллина. В этом эксперименте конститутивно активная и доминантная отрицательная активность Shp2-фосфатазы сравнивалась с активной и неактивной ак.......

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны этапы разработки, определения характеристик и применения хемогенетически контролируемых фосфатаз. Инструмент RapR-Shp2 основан на регулируемом рапамицином переключателе, вставленном в каталитический домен Shp2. Сильной стороной этого с.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы выражают признательность доктору Джордан Фаузер за ее вклад в разработку RapR-Shp2 и связанных с ним протоколов. Работа была поддержана премией 5R35GM145318 от NIGMS, премией R33CA258012 от NCI и премией P01HL151327 от NHLBI.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm RoundWarner Instruments64-0715
1.5 mL TubesUSA Scientificcc7682-3394
2x Laemmli BufferFor 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 CellsATCCCRL-1555
AgarsoseGoldBiotechA-201
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio-products100-106Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/APublished in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dyeinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a competent cellsNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
DNA LadderGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI EnzymeNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTAAcros409910250
Fibronectin from bovine plasmaSigmaF1141
FuGENE(R) 6 Transfection ReagentPromegaE2692transfection reagent
Gel extraction KitThermo ScientificK0692GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid StainGoldBioG-740-500
Gel Loading Dye Purple 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T CellsATCCCRL-11268
HeLa CellsATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ Processing SoftwareN/AN/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Imidazole Buffer25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
Lysis Buffer20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLABMathWorksN/AR 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis SoftwareN/AN/A
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Mineral OilSigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 wellBio-Rad4561085
Molecular Biology Grade WaterCorning46-000-CV
Multiband Polychroic MirrorChroma Technology89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objectiveOlympusN/A
PBS w/o Ca and MgCorning21-031-CV
PCR TubeslabForce1149Z650.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo ScientificF630S
PrimersIDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
PVDF MembranesBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
RapamycinFisherAAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodiumCorning25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1for electrophoresis
Wash Buffer20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-MercaptoethanolFisher ChemicalO3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR AntibodyCell Signaling2232
Anti-Erk 1/2 AntibodyCell Signaling9102
Anti-Flag AntibodyMillipore-SigmaF3165
Anti-GAPDH AntibodyinvitrogenAM4300
Anti-GFP AntibodyClontech632380
Anti-mCherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-paxillin AntibodyThermo FischerBDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 AntibodyCell Signaling2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 AntibodyCell Signaling9101
Anti-phospho-paxillin Y31 AntibodyMillipore-Sigma05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 AntibodyCell Signaling14008
Anti-PLCγ AntibodyCell Signaling5690

Ссылки

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены