Идентификация инфицированных EcoHIV клеток у трансгенных мышей, манипулируемых микроглией

Резюме

В этом протоколе описывается, как комбинация инфекции EcoHIV с мышами Tmem119-EGFP предлагает ценную биологическую систему для исследования изменений микроглии и вирусных резервуаров в моделях нейрокогнитивных расстройств, ассоциированных с ВИЧ, у грызунов.

Аннотация

Комбинированная антиретровирусная терапия (АРТ) значительно улучшила качество жизни людей, живущих с ВИЧ (ЛЖВ). Тем не менее, более 4 миллионов ЛЖВ старше пятидесяти лет сталкиваются с ВИЧ-ассоциированными нейрокогнитивными расстройствами (РУК). Чтобы понять, как ВИЧ влияет на центральную нервную систему, необходима надежная и осуществимая модель ВИЧ. Ранее на модели крысы была разработана новая биологическая система с использованием химерной инокуляции ВИЧ (EcoHIV) для исследования нейрокогнитивных нарушений и синаптической дисфункции. Тем не менее, остается серьезной проблемой прояснение нейроанатомического распределения EcoHIV, в частности, его дифференциальной экспрессии в различных типах клеток мозга. В текущем исследовании EcoHIV с флуоресцентным мечением mScarlet был модифицирован и ретроорбитально введен мышам Tmem119-EGFP (которые экспрессируют усиленный зеленый флуоресцентный белок в основном в микроглии), чтобы определить, являются ли микроглии основным типом клеток, ответственным за экспрессию вируса и резервуары ВИЧ в мозге. Текущие данные показывают, что: (1) in vitro флуоресцентные сигналы EcoHIV-mScarlet были преимущественно локализованы в микроглиеподобных клетках среди первичных клеток мозга грызунов; (2) in vivo инъекция EcoHIV-mScarlet мышам Tmem119-EGFP индуцировала значительную экспрессию ВИЧ в мозге мыши. Ко-локализация сигналов mScarlet и EGFP позволяет предположить, что микроглия является основным типом клеток, несущих ВИЧ в мозге. В целом, EcoHIV у грызунов предлагает ценную биологическую систему для изучения изменений микроглии, вирусных резервуаров в мозге и неврологических механизмов нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ.

Введение

Несмотря на огромную пользу от антиретровирусной терапии, люди, живущие с ВИЧ (ЛЖВ), по-прежнему испытывают нейрокогнитивные расстройства. Чтобы лучше понять нейронные механизмы ВИЧ-ассоциированного нейрокогнитивного расстройства (РУК), существует острая потребность в моделях ВИЧ для дальнейшего выяснения участия конкретных типов клеток в NeuroHIV.

Трансгенная крыса с ВИЧ-1, которая подвергается конститутивному воздействию вирусных белков ВИЧ-1, является популярной моделью грызунов, используемой для исследования нейрокогнитивных расстройств 1,2,3,4 и нейроанатомических изменений ^5,6,7, связанных с КИЛД. Функциональная делеция доменов gag и pol предотвращает репликацию вируса, что делает трансгенную крысу с ВИЧ-1 незаразной ^8,9. Недавно Potash et al. ¹⁰ сообщили о модели химерной инфекции ВИЧ (EcoHIV) у мышей, а затем распространили ее на крыс, что может быть полезно для дальнейших исследований^{расстройств, связанных} с употреблением психоактивных веществ. В этой новой биологической системе наблюдалась системная инфекция ВИЧ-1 наряду со многими клиническими особенностями ВИЧ-1 у людей, включая вовлечение лимфоцитов и макрофагов, противовирусные иммунные реакции, нейроинвазивность и воспаление мозга.

Микроглия играет важную роль в поддержании функции мозга и гомеостаза в качестве специализированных макрофагов мозга. Чтобы отличить микроглию от близкородственных типов клеток (например, моноцитов крови, периваскулярных макрофагов, менингеальных макрофагов), в текущем исследовании использовалась линия мышей Tmem119-EGFP. В предыдущих исследованиях сообщалось, что трансмембранный белок 119 (Tmem119) проявляет исключительно специфичный для микроглии паттерн экспрессии в тканях мозга грызунов и человека 12,13,14,15. Сигнал EGFP у мышей Tmem119-EGFP наблюдался по всему мозгу и локализовался специфически в клетках микроглии.

В настоящем исследовании мышам Tmem119-EGFP были инокулированы вирус EcoHIV-mScarlet, и были идентифицированы клетки, положительные на EcoHIV в центральной нервной системе. В данной статье мы представляем протокол инокуляции EcoHIV-mScarlet у мышей Tmem119-EGFP , обеспечивающий надежную модель терапевтического воздействия на микроглиальные изменения при ВИЧ.

протокол

Комитет по уходу за животными и их использованию при Университете Южной Каролины утвердил все протоколы для животных (федеральный номер гарантии: D16-00028). Все эксперименты строго следовали рекомендациям, установленным Национальными институтами здравоохранения в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию. Мышей Tmem119-EGFP (возраст 30 дней, самец, масса тела 23-26 г) были получены из коммерческого источника и размещены в помещениях, аккредитованных AAALAC. Все животные содержались по 12-12-часовому циклу свет-темнота со свободным доступом к пище и воде. Подробная информация о животных, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Упаковка EcoHIV-mScarlet в ячейки 293FT

1. Инкубируйте ячейки размером 293 фута в колбе 75 см² с желатиновым покрытием. Поддерживайте рост клеток до 30% сливаемости при трансфекции.
2. Проводят трансфекцию плазмидной ДНК (15 мкг) EcoHIV-mScarlet (Дополнительный файл 1) с использованием Липофектамина 3000 (22,5 мкл) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
3. Культивируют клетки в среде DMEM с 10% сывороткой FBS в течение 3 суток при 37 °С.
4. Собирают условную среду с вирусной суспензией. Центрифуга при 500 × г в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл в стерильную пробирку объемом 50 мл.
5. Добавьте в вирусную смесь определенное количество концентратора Lenti-x (в соотношении 1:3) (например, 8 мл концентратора на 24 мл вирусной смеси). Аккуратно переверните трубку пять раз.
6. Смесь концентратора вирус-ленти выдерживают при температуре 4 °C в течение 2 дней. Центрифуга при 1 500 × г, 45 мин, 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость как можно больше с помощью пипетки.
7. Повторно суспендируйте гранулу с предварительно охлажденным 200 мкл 100 мМ PBS. Храните вирус при температуре -80 °C.
   Примечание: Детали упаковки EcoHIV-mScarlet в клетках размером 293FT были описаны в нашем предыдущем исследовании¹⁶. Не делайте вихрей и не вводите пузырьки воздуха в вирусный раствор.

2. Инфекция EcoHIV-mScarlet в первичных клетках мозга крыс

1. Провести первичную изоляцию клеток мозга из плодов крыс (18 дней) в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹⁶.
2. Перенесите диссоциированные клетки в 12-луночные планшеты с предварительно покрытым поли-L-лизином покрытием со стеклянными вставками, содержащими 1 мл среды DMEM/F12 плюс 10% FBS. Замените среду на следующий день на нейробазальную среду добавкой B27.
3. Культивируйте первичные клетки мозга плода в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 3 недель.
4. Добавьте в питательную среду EcoHIV-mScarlet (60 μл, 1,26 ×^{10 6} ТЕ/мл). Инкубируйте культивируемые клетки мозга с помощью EcoHIV-mScarlet в течение 6 дней.
5. Зафиксируйте клетки 4% PFA и выполните иммуноокрашивание инфицированных клеток мозга с использованием специфических первичных антител (CD11b/c, Iba1).
6. Получение изображений с использованием объектива 40× в системе конфокальной микроскопии.

3. Инфекция вируса EcoHIV-mScarlet в первичных клетках глии взрослых мышей

1. Обезболить взрослых мышей 5% севофлураном в течение 5 минут (в соответствии с утвержденными в учрежденном учреждении протоколами). Простерилизовать кожу головы с помощью 70% EtOH.
2. Убедившись, что мышь больше не реагирует на вредные раздражители, используйте стерилизованные заточенные ножницы для обезглавливания. Переложите голову в новую чашку Петри, наполненную 5 мл HBSS.
3. Вскрыть кожу головы и перенести мозговую ткань в другую чашку Петри, содержащую 5 мл стерилизованного HBSS. Снимите мозговые оболочки и перенесите лобную кору в 2 мл HBSS.
4. Добавьте в смесь 20 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА. Выдерживать в течение 15 мин при комнатной температуре; Аккуратно поворачивайте трубку каждые несколько минут.
5. Диссоциированные клетки перенесите в колбу 75 см² с предварительно покрытым поли-L-лизином, содержащую 10 мл среды DMEM/F12 и 10% FBS.
6. Культивирование клеток при 37 °C, 5%_CO2 в инкубаторе_, до 90% конфлюенции. Расщепляйте клетки мозга с помощью 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА.
7. Субкультивировать клетки мозга в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм, содержащие 5 мл питательной среды DMEM/F12 до 80% конфлюенции.
8. Добавьте в питательную среду EcoHIV-mScarlet (8 μл, 1,26 ×^{10 6} МЕ/мл). Инкубируйте глиальные клетки мыши в течение 2 дней.
9. Ежедневно проверяйте красные (mScarlet) флуоресцентные сигналы под флуоресцентным микроскопом.

4. Ретроорбитальная инъекция вируса EcoHIV-mScarlet мышам Tmem119-EGFP

1. Используйте 3% севофлуран для обезболивания мышей Tmem119-EGFP (как самцов, так и самок в возрасте 30 дней) до тех пор, пока они не перестанут реагировать на вредные раздражители.
2. Закрепите мышей в боковом положении так, чтобы глаз для инъекции был направлен вверх, а дыхание осуществлялось через носовой конус, который подключен к системе анестезии. Используйте носовой конус соответствующего размера для обеспечения непрерывной анестезии.
3. Разморозьте EcoHIV-mScarlet на льду. Залейте вирусный раствор во внутриглазной инъекторный шприц с тупой иглой 33 G.
4. Поместите мышь в правое боковое положение лежа и держите ее голову лицом влево. Определите расположение медиального кантуса в качестве места инъекции.
5. После проптозации глаза медленно и осторожно введите иглу (под углом 45 градусов) в медиальный кантус глаза. Осторожно введите иглу вперед в сосуды за глазным яблоком (ретроорбитальный синус).
6. Осторожно введите 6,5 мкл EcoHIV-mScarlet (1,26 ×^{10 6} TU/мл, двусторонняя инокуляция глаза) в ретроорбитальный синус. Осторожно извлеките иглу из ретроорбитального синуса и аккуратно надавите на веки, чтобы обеспечить гемостаз.
7. Нанесите лубрикант на глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы или травмирование.
8. Дайте мышам прийти в себя в камере восстановления с грелкой, пока они не проснутся.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скос иглы не должен располагаться слишком глубоко, чтобы не разорвать артерии или не сломать кости. Время инфузии вируса зависит от множества факторов (например, объема инъекции, титра, размера животного). Для инфузии вируса EcoHIV значительная экспрессия наблюдалась через неделю после ретроорбитальных инъекций 11,16,17.

5. Визуализация срезов тканей мозга

1. Глубоко обезболить мышей с помощью 5% севофлурана. Перейдем к шагу 5.2, когда мыши не проявляют никакой реакции на вредные раздражители и рефлексы отсутствуют.
2. Держите мышей в лежачем положении внутри вытяжного шкафа для химикатов.
3. Раскройте кожу вдоль средней линии грудной клетки. Отделите диафрагму и откройте грудную клетку ножницами.
4. Введите иглу 22 G1 1/2 в левый желудочек. Откройте правое предсердие ножницами.
5. Перфузируйте 50 мл предварительно охлажденного 100 мМ PBS. Проведите 100 мл предварительно охлажденного 4% параформальдегидного буфера¹⁶.
6. Удаляем весь мозг мыши¹⁶.
7. Закрепите на ночь с 4% параформальдегидом.
8. Закрепите мозговую ткань с помощью тканевого клея на металлической платформе вибратома. Вырезать коронковые участки толщиной 50 мкм лезвиями из углеродистой стали.
9. Поместите срезы мозга на предметные стекла с помощью кисти. Немедленно добавьте 0,1 мл монтажной среды, предотвращающей выцветание, в каждую секцию.
10. Наденьте покровное стекло размером 22 мм x 50 мм на мозговые секции. Просушите супер-морозные горки в темноте в течение 1 суток.
11. Сконфигурируйте систему конфокального микроскопа с увеличением 60× (A/1,4, масло) и установите интервал в Z-плоскости 0,15 мкм с размером точечного отверстия 30 мкм и радиусом обратного проекции точечного отверстия 167 нм.
12. Используйте длины волн 488 нм и 594 нм для получения многоканальных изображений интересующих областей мозга.

Результаты

Фрагмент mScarlet (1858.н.), содержащий энзимные сайты "Cla1" на 3'-конце и "Not1" на 5'-конце, был вставлен в лентивирусный вектор pNL4-3-EcoHIV (рис. 1). Для подтверждения экспрессии EcoHIV-mScarlet первичные клетки мозга, выделенные из коры эмбрионов E18 крыс, обрабатывали EcoHIV-mScarlet (60 μл, 1,26 × 10⁶ TU/мл) в течение 6 дней in vitro. Данные на рисунке 2 показали, что красные флуоресцентные сигналы mScarlet в основном локализованы в глиальных типах клеток на основе различной морфологии клеток. Кроме того, мечение CD11b/c и Iba1 (клеточные маркеры микроглии) показало, что сигналы mScarlet были колокализованы с клетками CD11b/c + и/или Iba1+. Данные показали, что микроглия является основным типом клеток распределения EcoHIV-mScarlet in vitro. В культивируемых клетках не было выявлено значительной нейрональной инфекции (дополнительный рисунок 1).

Затем инфекция EcoHIV-mScarlet была протестирована на первичных смешанных глиальных клетках взрослых мышей. Для этого клетки смешанной глии сначала выделяли и очищали от взрослых мышей (2 месяца) и инфицировали EcoHIV-mScarlet (8 μл, 1,26 × 10⁶ TU/мл) в течение 2 дней. Изображения на рисунке 3 показали, что EcoHIV-mScarlet успешно заразил взрослую мышиную глию.

Для дальнейшего изучения характера распределения EcoHIV-mScarlet в мозге мыши, в частности, для идентификации инфицированного типа клеток, EcoHIV-mScarlet вводили ретроорбитально в мышиную линию Tmem119-EGFP , в которой микроглия была специфически помечена сигналами EGFP без каких-либо других типов конфликтов макрофагов⁵. Результаты на рисунке 4 (также на дополнительном рисунке 2) показывают, что сигналы красной флуоресценции mScarlet наблюдались в EGFP-положительных клетках, что позволяет предположить, что микроглия является основным типом клеток экспрессии EcoHIV в мозге мышей.

Рисунок 1: Векторная карта EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Инфекция EcoHIV-mScarlet в первичных клетках мозга крыс. (A,E) Репрезентативные изображения окрашивания CD11b/c в первичных клетках мозга. Клетки мозга были выделены из эмбрионов крыс E18 и инфицированы вирусом EcoHIV-mScarlet в течение 6 дней. (В,Ж) Репрезентативные изображения флуоресцентных сигналов mScarlet от клеток мозга in vitro . (С,Г) Репрезентативные изображения окрашивания Iba1 в первичных клетках мозга. (Д,Н) Объединены изображения тройной мечения CD11b/c, mScarlet и Iba1. Масштабные линейки: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Инфекция EcoHIV-mScarlet в первичных смешанных глиальных клетках мыши. (A,B) Репрезентативные конфокальные изображения распределения mScarlet in vitro. Первичные клетки смешанной глии были выделены от взрослых мышей C57BL6 (2-месячного возраста) и культивировались в течение 2 недель до вирусной инфекции. EcoHIV-mScarlet добавляли в культуральную среду на два дня и делали снимки под объективом 60× конфокального микроскопа. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Распределение EcoHIV-mScarlet в линии мышей Tmem119-EGFP . (А,Б) Объединенные изображения сигналов mScarlet/EGFP/ToPro3 в срезах мозга. Желтая рамка обозначает целевую область (B). Масштабная линейка: 300 мкм. (C) Репрезентативное изображение распределения mScarlet во внешнем плексиформном слое обонятельной области линии мыши Tmem119-EGFP . (D) Репрезентативное изображение распределения EGFP. Флуоресцентные сигналы были локализованы в клетках микроглии в мышиной линии Tmem119-EGFP . (E) Репрезентативное изображение окрашивания ядра TO-PRO-3. Масштабные линейки: 300 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Окрашивание MAP2 и MOG первичных клеток мозга крыс, инфицированных вирусом EcoHIV-mScarlet. Масштабные линейки: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Конфокальные изображения инфекции EcoHIV-mScarlet в мышиной линии Tmem119-EGFP . Масштабные линейки: 75 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Последовательность плазмиды ДНК EcoHIV-mScarlet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В настоящем исследовании было обнаружено, что (1) новый EcoHIV-mScarlet успешно инфицировал первичные клетки мозга крыс in vitro; (2) тройное мечение mScarlet, CD11b/c и Iba1 идентифицировало микроглию как преобладающий тип клеток для экспрессии EcoHIV в клетках мозга крыс in vitro; (3) первичные клетки мозга мышей от взрослых in vitro еще раз свидетельствуют об инфекции EcoHIV-mScarlet; (4) Распределение EcoHIV-mScarlet в линии мышей Tmem119-EGFP продемонстрировало специфичную для микроглии схему распределения инфекции EcoHIV.

Новые исследования показали, что различные типы клеток мозга, идентифицированных в центральной нервной системе (нейроны, астроциты, микроглии, олигодендроциты и т.д.), демонстрируют функциональные и транскриптомные изменения во время ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств^18,19. Например, астроциты составляют 30-70% мозга и осуществляют наблюдение для поддержания гомеостаза^мозга20. Астроциты также модулируют иммунную функцию и регулируют секрецию мультицитокинов и хемокинов, особенно в ситуации воспаления мозга и нейродегенерации при ВИЧ ^21,22. ВИЧ-инфекция микроглии не только приводит к непрерывному высвобождению вирусных белков и провоспалительных цитокинов и хемокинов, но и обеспечивает преобладающие источники вирусных резервуаров ВИЧ 23,24,25,26. Кроме того, активированная микроглия вносит свой вклад в важнейшую иммунологическую функцию в ЦНС; однако длительная активация может также усугубить нейродегенерацию в прогрессировании ВИЧ^10,27. Олигодендроциты также играют важную функцию, в том числе высвобождают несколько нейротрофинов (таких как фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозга и т. д.)²⁸. Предыдущее исследование показало, что количество олигодендроцитов значительно снизилось в мозге больных СПИДом, что может свидетельствовать о прямом повреждении олигодендроцитов вирусными белками ВИЧ²⁹. Таким образом, конкретный тип модели инфекции ВИЧ, управляемой клетками, должен обеспечить фундаментальные средства идентификации дифференциальных функций различных клеток мозга после инфицирования. В данном исследовании была разработана биологическая система, имитирующая особенности ВИЧ-1 путем химерной инокуляции ВИЧ (EcoHIV). Эта инокуляция ВИЧ также была объединена с линией мышей Tmem119-EGFP для создания и валидации модели ВИЧ у грызунов, манипулируемой микроглией.

Тем не менее, следует признать ограничения настоящего исследования. Было несколько негативных клеток Iba1/CD11b/c, которые представляли флуоресцентные сигналы mScarlet in vitro. Другие типы клеток мозга, такие как макрофаги мозга или перициты, могут быть вовлечены в инфекцию EcoHIV, или, наоборот, среда клеточной культуры может способствовать аберрантным паттернам инфекции по сравнению с инокуляцией in vivo . Будущие исследования на животных должны еще больше прояснить функцию микроглии mScarlet+ в процессе инфекции EcoHIV и определить региональное распределение микроглии mScarlet+EcoHIV в мозге. Кроме того, нейрокогнитивные изменения, возникающие в результате инфекций микроглии, также могут быть рассмотрены в этой модели грызунов. В целом, инокуляция EcoHIV-mScarlet мышей Tmem119-EGFP обеспечивает новую модель и исследовательскую стратегию для изучения микроглиальных механизмов нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
33 G, Small Hub RN Needle, (Point Style: 3, Needle Length: 19.25 mm)	Hamilton	7803-05
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100x
C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J	The Jackson Laboratory	Strain #:031823
Corning BioCoat Gelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Feather Double Edge Carbon Steel Blades	Ted Pella, inc.	121-9
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Human recombinant anti-CD11b antibody	Miltenyi Biotec	130-120-214	1:50 dilution
Intraocular Injector Syringe (6.5 µL), Removable Needle	Hamilton	6609071-01
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Invitrogen One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Fisher Scientific	C404052
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PELCO easiSlicer Vibratory Tissue Slicer	Ted Pella, inc.	11000
PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive	Ted Pella, inc.	10033
PELCO Pro Specimen Retrievers	Ted Pella, inc.	101-33
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Rabbit monoclonal anti-Iba1 antibody	Abcam	ab178847	1:500 dilution
RN Compression Fitting 1 mm	Hamilton	55750-01
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
Sprague Dawley pregnant rat	Inotiv
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
To-Pro-3	ThermoFisher Scientific	T3605	Nucleus staining kit
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200-056
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086