Стандартизация нового полуавтоматического программного обеспечения для измерения наростов нейритов

Резюме

Анализы роста нейритов дают количественную оценку регенеративных нейронных процессов. Преимущество этого полуавтоматического программного обеспечения заключается в том, что оно сегментирует тела клеток и нейриты отдельно, создавая маску, и измеряет различные параметры, такие как длина нейритов, количество точек ветвления, площадь кластера «клетка-тело» и количество кластеров клеток.

Аннотация

Эффективные методы визуализации в реальном времени имеют решающее значение для оценки морфологии нейронов с целью измерения роста нейритов в режиме реального времени. Правильное измерение роста нейритов было давней проблемой в области исследований в области нейробиологии на протяжении многих лет. Этот параметр служит краеугольным камнем в многочисленных экспериментальных установках in vitro , начиная от диссоциированных культур и органотипических культур и заканчивая клеточными линиями. Количественно оценивая длину нейрита, можно определить, сработало ли конкретное лечение или усилилась регенерация аксонов в различных экспериментальных группах. Цель данного исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать надежность и точность программного обеспечения для анализа разрастания нейритов Incucyte Neurotrack. Это полуавтоматическое программное обеспечение доступно в системе покадровой микроскопии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с широко используемыми методологиями при количественной оценке длины нейритов в фазово-контрастных изображениях. Алгоритм маскирует и количественно оценивает несколько параметров на каждом изображении и возвращает метрики нейронных клеток, включая длину нейритов, точки ветвления, кластеры клетка-тело и площади кластера клеток-тел. Во-первых, мы проверили надежность и точность программного обеспечения, сопоставив его значения с данными ручного плагина NeuronJ из Фиджи. Во-вторых, мы использовали алгоритм, который способен работать как на фазово-контрастных изображениях, так и на иммуноцитохимических изображениях. Используя специфические нейрональные маркеры, мы подтвердили возможность проведения анализа роста нейритов на сенсорных нейронах in vitro на основе флуоресценции. Кроме того, это программное обеспечение может измерять длину нейритов при различных условиях затравки, начиная от отдельных клеток и заканчивая сложными нейронными сетями. В заключение следует отметить, что программное обеспечение предоставляет инновационную и экономичную по времени платформу для анализа роста нейритов, прокладывая путь к более быстрому и надежному количественному определению.

Введение

В седалищных нервах можно измерить регенерацию аксонов¹. Кроме того, исследования in vitro показали возможность мониторинга вырастания аксонов ^2,3 для понимания его различных фаз, от прорастания аксонов до аксональной дегенерации, как в здоровых, так и в поврежденных нейронах. Отслеживая эти процессы, можно измерить такие параметры, как аксональная полярность, инициация, стабильность и ветвление. Последний параметр имеет решающее значение для понимания нейропатического восприятия боли ^4,5,6

протокол

1. Сканирование сосуда на машине

ПРИМЕЧАНИЕ: Детектирование осуществляется с помощью встроенной камеры Basler Ace 1920-155 мкм.

1. Откройте программу, нажав «Подключиться к устройству » и выбрав «Расписание» - «Для приобретения». Затем нажмите знак + .
2. Укажите, будет ли судно сканироваться повторно или только 1 раз, выбрав опцию «Сканировать по расписанию » или «Сканировать один раз сейчас» соответственно.
3. Выберите «Создать », чтобы создать совершенно новое судно ....

Результаты

Алгоритм измерения нароста нейритов способен обнаруживать нейриты как в нейронных сетях, так и в отдельных нейронах. Он создает желтую маску, которая сегментирует объекты с высокой контрастностью, такие как тела клеток, клеточный мусор, мертвые клетки, эксплантации т.......

Обсуждение

Точное измерение того, как растут нейроны в здоровых, травмированных и больных условиях, является критическим параметром во многих экспериментальных установках в области нейробиологии. Будь то работа с органотипическими культурами целых эксплантов DRG или диссоциир?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660