Быстрый метод ограничения и безопасного обращения с пчелами в полевых условиях

Резюме

Мы демонстрируем проверенный метод безопасного обращения с пчелами, собранными в полевых условиях. Этот метод позволяет быстро манипулировать, идентифицировать, брать генетические образцы и подтверждать взаимодействие растений и насекомых с помощью пыльцы, собранной во время отбора проб. Легко адаптируемый, этот подход предлагает экономически эффективные, нелетальные средства для изучения редких групп насекомых.

Аннотация

Улучшение понимания основ биологии и экологии многих насекомых-опылителей, особенно специализированных или редких таксонов, является приоритетной задачей для многих исследователей. Таким образом, часто возникает необходимость во временном ограничении собранных в полевых условиях организмов безопасным для них способом, чтобы получить информацию или поддержать дополнительные исследования. Этот протокол представляет собой тщательно протестированный, быстрый и недорогой полевой метод безопасного обращения с пчелами, заботящимися о сохранении природы, который может быть легко адаптирован к конкретным потребностям проекта, включая идентификацию организмов, удаление пыльцы, маркировку и/или сбор нелетальных образцов тканей для генетического анализа. Эта методология может служить дополнительной опцией в арсенале исследователя для использования при возникновении определенных сценариев. Предполагается, что эта методология может быть адаптирована для использования с другими видами насекомых, а также использоваться индивидуумами с различным опытом и уровнем квалификации. Он может быть очень ценным для исследователей, изучающих специализированных пчел или проводящих исследования, специфичные для хозяина. Сбор данных, ставший возможным благодаря этому протоколу, будет иметь неоценимое значение для помощи исследователям в устранении критических пробелов в данных по многим видам опылителей, сетевым структурам растений и опылителей, а также инициативам по сохранению и управлению опылителями.

Введение

Растущее количество фактических данных свидетельствует о сокращении популяции диких пчел и других опылителей и сопутствующих изменениях в сообществе опылителей 1,2,3,4. Продолжающиеся потери угрожают самой службе опыления насекомыми, жизненно важной для поддержания биоразнообразия, функционирования экосистем и сельскохозяйственного производства⁵. Более того, для многих диких пчел, особенно редких видов, существуют значительные пробелы в знаниях, которые могут препятствовать принятию надлежащих мер по управлению и сохранению ^6,7.

Чтобы помочь восполнить эти недостатки данных, исследователи разработали различные методы для изучения насекомых-опылителей, связанного с ними использования среды обитания и их цветочных предпочтений. В то время как обычно используются ловушки-чаши, ловушки с синим флюгером, ловушки для недугов, ловушки для возникновения ситуации и прямой сбор с помощью ручной сетки, многие из этих методов имеют существенные недостатки 8,9,10,11. Широко используемые методы идентификации опылителя могут привести к гибели организма, независимо от того, должен ли образец быть идентифицирован в лабораторных условиях (например, с помощью микроскопа). Смертность может быть оправданной и необходимой для многих исследований насекомых. Тем не менее, при работе с находящимися под угрозой исчезновения, редкими или малоизученными насекомыми, статус популяции которых ограничен или неясен, исследователи должны снизить смертность организмов, травмы или стресс, чтобы снизить вероятность негативного воздействия на популяции этих насекомых. Поэтому при работе с видами, находящимися под угрозой исчезновения, или видами, которые могут быть легко идентифицированы по их ключевым отличительным признакам, следует по возможности использовать менее разрушительные подходы к отбору проб.

Нелетальные методы, которые были предложены для сбора генетического материала у пчел, включают сбор фекалий, эксувий¹² и кончиков крыльев¹³. Тем не менее, использование этих методов на пчелах, собранных в поле, может быть несостоятельным из-за необходимого времени и/или потенциального воздействия на крылья, что негативно влияет на полет и другое поведение. Было показано, что частичное удаление усиков не ставит под угрозу выживаемость отобранных пчел эуглоссина¹⁴. Аналогичным образом, отбор проб терминальной части предплюсны средней части ноги не привел к значительному снижению выживаемости рабочих Bombus terrestris ¹⁵. Дополнительный нелетальный метод отбора проб включает в себя сбор остатков белка путем временного погружения пчел в буферный раствор и последующего выпуска их¹⁶. Анализ выживаемости показал, что не было существенных различий между промытыми и непромытыми пчелами. У каждого метода есть ограничения, которые следует учитывать при решении конкретных исследовательских вопросов и общих целей проекта.

Точная таксономическая идентификация организмов имеет решающее значение для эффективных исследований. Однако для многих таксонов насекомых-опылителей это чрезвычайно зависит от интересующего вида, а также от уровня знаний и опыта исследователя или наблюдателя. Несмотря на то, что многие виды пчел могут быть идентифицированы в полевых условиях, наличие доказательств, подтверждающих это наблюдение, может иметь решающее значение. В то время как большинство исследований опылителей обычно собирают и сохраняют особей в качестве доказательств, использование фотографий и видео, а также трехмерной видеосъемки с использованием виртуальной реальности может быть использовано в качестве прокси для различения определенных видов без жертвы^{наблюдаемых} особей. Дифференциация между некоторыми видами может потребовать особого внимания и фотографирования конкретных морфологических особенностей; В таких ситуациях организмами необходимо иметь возможность манипулировать и удерживать их в уникальном положении, чтобы можно было надежно сфотографировать сложные отличительные признаки.

Временное удержание пчел для идентификации может быть осуществлено несколькими способами, включая охлаждение образца и/или использование углекислого газа для замедления пчел^18,19. Тем не менее, эти методы могут изменить поведение, в результате чего обработанные пчелы медленнее восстанавливают активность, тем самым, возможно, влияя на поиск пищи, физическую форму организма или увеличивая риск хищничества 20,21,22. Кроме того, такие методы в конечном итоге увеличивают время, в течение которого организмы находятся в изоляции и с ними обращаются. Это, в свою очередь, увеличивает стресс организма и время обработки полей. Поэтому было бы весьма желательно использовать более безопасные и эффективные методологии.

В ряде исследований использовалась пыльца, собранная от пчел или из других источников, чтобы лучше понять предпочтения производителей пищи, построить сети взаимодействия растений и опылителей, определить загрязнение окружающей среды (например, остатки пестицидов) и оценить экологию питания 23,24,25,26,27,28,29. Многие пчелы будут самостоятельно ухаживать за собой, будучи запертыми в контейнере. Поэтому были использованы нелетальные методы отбора проб пыльцы^{(например}, микроцентрифужные пробирки). Тем не менее, в тех случаях, когда самостоятельный уход не происходит, использование более тактильного контейнера, такого как закрывающиеся пластиковые пакеты, используемые в этом протоколе, позволяет мягко надавливать на определенные части тела, чтобы пыльца соприкасалась с пластиковым пакетом, что приводит к более высокой вероятности получения образца пыльцы, чем использование традиционных жестких контейнеров.

Здесь мы представляем протокол, который был хорошо протестирован на трех таксонах пчел, находящихся под угрозой. Несмотря на трудоемкость, он позволяет всесторонне собирать данные от насекомых-опылителей, сводя к минимуму угрозу смертности отдельных организмов. Общая цель использования этой методологии заключается в том, чтобы предоставить безопасные и эффективные средства для отлова, идентификации и безопасного выпуска насекомых. Дополнительным преимуществом этого протокола является то, что он преодолевает многие ограничения традиционного сбора насекомых. Он обеспечивает простой способ маркировки отдельных особей, сбора нелетального генетического материала и сбора образцов пыльцы, сводя к минимуму время обработки и стресс для организма. Несмотря на^{то, что} традиционные методы сбора насекомых имеют много преимуществ, чтобы помочь преодолеть некоторые из их ограничений, мы создали альтернативу, позволяющую изолировать насекомых для идентификации перед быстрым и безопасным выпуском. В зависимости от целей проекта, могут быть предприняты дополнительные шаги, пока пчела находится в изоляции для сбора других важных данных.

протокол

1. Подготовка полевых коллекций

1. Подтверждение целей проекта (например, идентификация организма, забор образцов генетических тканей и т. д.).
2. Просмотрите таблицу материалов и соберите все элементы, относящиеся к целям проекта.
3. Убедитесь, что все цифровое оборудование (например, смартфон, фотоаппарат, портативная система глобального позиционирования [GPS]) полностью заряжено, а запасные батареи заряжены и упакованы.

2. Захват и обезопасивание организма

1. Запишите параметры участка, представляющие интерес по прибытии на место, включая дату, время начала, участок/местоположение поля, а также любую другую соответствующую информацию (например, погодные условия, доминирующие почвопокровные растения, цветущие растения и т. д.), которая может потребоваться (Рисунок 1).
2. Поймайте отдельную пчелу, представляющую интерес, с помощью соответствующей техники сетки. Используйте ручную сетку от насекомых или сачок в зависимости от основных видов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для отлова насекомых также могут быть использованы другие методы отлова, такие как сбор с помощью пробирки/центрифуги.
3. Визуально понаблюдайте за экземпляром через сетчатый мешок, чтобы определить, похож ли он на интересующий таксон. Если нет, безопасно отпустите образец и продолжайте обследование.
4. Если экземпляр выглядит как очаговый вид, закрепите образец внутри сетчатого мешка так, чтобы он не смог сбежать (например, наложив верхнюю часть сетчатого мешка внахлест на раму, скрутив/ограничив горлышко сетчатого мешка или иным образом закрыв любые потенциальные выходы).
5. Соберите закрывающийся пакет для образцов и откройте его.
6. Убедитесь, что интересующая пчела находится рядом с кончиком сетчатого мешка.
7. Одной рукой возьмитесь за сетчатый мешочек непосредственно под экземпляром. Держите сетчатый мешок так, чтобы кончик (где находится насекомое) был направлен вверх, а отверстие для сетки (т.е. обруч) свисало внизу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство насекомых фототрофны и, находясь взаперти, обычно летят/ползут к свету.
8. Другой рукой (т.е. рукой, не держащей сетчатый мешок) проведите закрывающийся пакет для образцов в отверстие сетки и через сетчатый мешок, пока он не достигнет руки, находящейся непосредственно под образцом.
9. Осторожно отпустите рукоятку руки, удерживая образец ровно настолько, чтобы рука, держащая закрывающуюся сумку для образцов, могла переместиться в ограниченное пространство вместе с образцом. Помните о местонахождении особи в пределах ограниченного пространства, чтобы снизить вероятность укуса, причинения вреда особи и побега.
10. Манипулируйте закрывающимся пакетом для образцов, чтобы он открылся достаточно широко, чтобы внутрь мог проникнуть образец из насекомых. Для этого надавливайте на пломбу с обеих сторон или поворачивая пакет большим и средним пальцами ниже пломбы.
11. Расположите закрывающуюся упаковку для образцов над образцом и осторожно переместите насекомое внутрь пакета. Как упоминалось ранее, поскольку большинство насекомых являются фототрофными, направляйте руку, содержащую закрывающийся пакет для образцов, к солнцу/небу, тем самым облегчая перемещение образца внутрь пакета.
12. Как только образец окажется внутри, плотно закройте закрывающийся пакет для образцов.
13. Извлеките закрывающийся пакет с образцом из сетки от насекомых.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку насекомые могут быстро и смертельно перегреться в герметичных пакетах, храните образец вдали от прямых солнечных лучей, в идеале в затененном месте или изолированном контейнере до обработки, и ограничьте время обработки.

3. Определите микроорганизм

1. Внимательно осмотрите образец, чтобы убедиться, что он представляет интерес. Если это другой вид, смело выпускайте его и продолжайте обследование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание причинения вреда образцу, никогда не оказывайте прямого давления на насекомое, когда оно находится внутри пакета. Образцы можно обездвижить, слегка надавливая на пластик или растягивая по периметру мешка, чтобы сумка натягивалась вокруг образца, тем самым ограничивая движения.
2. Если видовую принадлежность можно легко и точно подтвердить визуально, возьмите с собой фотоваучер (Рисунок 2). Записывайте любую дополнительную необходимую информацию об образце (например, время отлова, конкретное местоположение по GPS, посещенное растение, уникальные маркировки, наблюдение за размером или окраской, поведение перед отловом и т. д.).
3. Если для подтверждения идентичности необходимо осмотреть конкретные физические особенности, сделайте подробные макрофотографии, подчеркивающие эти ключевые особенности, через закрывающийся пакет для образцов (Рисунок 2).
4. Если фотографии достаточного качества для различения особенностей не могут быть получены с помощью пакета для образцов, подставьте представляющие интерес части тела образца для тщательного изучения, разрезав один из двух негерметичных угловых наконечников пакета для образцов (т.е. углы, которые сшиты вместе или не подлежат повторному запечатыванию). Например, вырежьте небольшое отверстие, чтобы обнажить только голову, живот или ногу (рисунок 3A-C). Для этого манипулируйте образцом таким образом, чтобы интересующая часть тела сначала перемещалась к срезному/угловому отверстию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения необходимой фотографии может потребоваться изменить размер и положение отверстия в сумке, а также ориентацию насекомого.
5. После того, как идентификация произошла, перейдите к соответствующим разделам для последующих и желаемых методов. См. раздел 4 о методе удаления члеников усиков, раздел 5 о маркировке насекомых и/или раздел 6 о получении образцов пыльцы.

4. Получение нелетальных генетических образцов из антенн

1. С помощью ножниц разрежьте по диагонали один из двух незапечатанных углов (т. е. углов, которые сшиты вместе или не подлежат повторному закрытию) пакета для многократного закрывания образца. Следите за тем, чтобы сделанный надрез был минимально больше ширины пчелиной головы (рисунок 4).
2. Манипулируйте образцом так, чтобы он двигался головой вперед к отверстию в вырезе/углу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть адаптирован для сбора других образцов тканей для генетического анализа (например, целой ноги, частичной ноги). Соответственно, размер и положение прорезанного отверстия в пакете, а также ориентация насекомого могут нуждаться в изменении для получения необходимого образца.
3. Как только голова пчелы высунется из пакета, осторожно надавите на окружающий пластик, чтобы он натянулся вокруг насекомого, ограничивая движения (рисунок 3A).
4. Если отверстие слишком большое, перекатите пакет через себя, чтобы еще больше ограничить отверстие и закрепить образец. Если вы не уверены в подходящем размере отверстия, выполните шаги 4.2 и 4.3 внутри сетки от насекомых или клетки для полетов, чтобы убедиться, что образец не улетит полностью. Используйте дополнительный мешок, если исходный угловой срез слишком большой.
5. Расположите пакет таким образом, чтобы голова насекомого находилась непосредственно над контейнером для сбора (например, микроцентрифужной пробиркой/флаконом, содержащим буферный раствор/этанол) и чтобы контейнер для генетического образца был соответствующим образом помечен уникальным идентификатором образца, соответствующим всем остальным данным образца (рисунок 3D).
6. С помощью чистых и стерилизованных ножниц для препарирования отрежьте часть одного сегмента усиков. Визуально осмотрите контейнер, чтобы убедиться, что образец находится внутри контейнера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При резке полезно работать над чистой, стерилизованной, светлой подложкой (например, Kimwipe). Это гарантирует, что если образец не попадет в контейнер для сбора проб, его можно будет легко извлечь с помощью щипцов с минимальным риском загрязнения.
7. Закройте крышку контейнера для сбора образцов тканей и поверните контейнер так, чтобы образец находился во взвешенном состоянии внутри раствора (например, буферного раствора/этанола).
8. Поместите контейнер для сбора образцов тканей (вместе с образцом антенны) в надежный контейнер, в идеале в прохладном, затененном месте, защищенном от прямых солнечных лучей и/или экстремальных температур, например, в полевом охладителе.
9. Безопасно отпустите образец рядом с первоначальной точкой захвата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образец также может быть помечен (см. раздел 5) перед выпуском, чтобы легко идентифицировать его как образец в случае его ревизии/повторения.

5. Маркировка организма

1. Поместив образец в закрывающийся пакет для образцов, прорежьте небольшое отверстие в середине пакета для образцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это отверстие является дополнением к отверстию, созданному в разделе 4. Отверстие не должно быть больше площади грудной клетки насекомого. Положение, где должно быть вырезано отверстие, может варьироваться в зависимости от размера насекомого и желаемой области маркировки.
2. Слегка надавливая на пластик с обеих сторон образца, маневрируйте насекомым так, чтобы грудная клетка оказалась прямо под отверстием (т.е. чтобы верхняя часть грудной клетки была открыта через мешок). Продолжайте с легким нажатием, чтобы убедиться, что образец остается на месте (Рисунок 5A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие участки маркировки могут быть лучше для определенных насекомых (Рисунок 5B). Некоторые пользователи считают более полезным увеличить существующее отверстие (из раздела 4) и захватить пчелу, удерживая ее грудную клетку, когда она появляется (рисунок 5C). Такой подход может увеличить вероятность укуса. Кроме того, устройства для маркировки маток медоносных пчел могут быть модифицированы для ограничения и маркировки пчел, если пользователю это проще. Однако этот метод требует переноса на другое устройство и может загрязнить образцы пыльцы.
3. С помощью маркера для краски (или другого материала для маркировки, который считается подходящим для интересующего таксона) пометьте образец в соответствии с заранее определенной методологией, специфичной для конкретного проекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Методы маркировки будут различаться в зависимости от целей и могут быть простыми, указывающими на то, что особь была поймана, или сложными, позволяющими идентифицировать особей (например, с использованием уникального цветового кодирования или узора) (Рисунок 5C).
4. Удерживайте образец на месте до тех пор, пока нанесенная метка не высохнет.
5. Сфотографируйте отмеченную особь для подтверждения уникальной окраски и цветового положения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторная поимка особей может быть легко и быстро сфотографирована непосредственно через закрывающуюся сумку для образцов (Рисунок 5D).
6. Безопасно отпустите образец рядом с первоначальной точкой захвата.

6. Сбор образцов пыльцы

1. Поместив образец в закрывающийся пакет для образцов, внимательно осмотрите его на наличие видимой пыльцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тип и количество пыльцы сильно варьируются, иногда пыльца не видна на образце невооруженным глазом. Если предыдущие шаги уже были выполнены, возможно, что остатки пыльцы от образца уже находятся в пакете.
2. Если на образце видна пыльца, ограничьте движение образца, слегка надавливая на пластик с обеих сторон.
3. С помощью пальца аккуратно потрите или прижмите пластик к щетинкам или пыльцесодержащей части тела, чтобы облегчить удаление пыльцы.
4. Если пыльца не видна на образце, увеличьте контакт между образцом и пластиком, чтобы увидеть, удалены ли мелкие остатки пыльцы из покрова.
5. По возможности убедитесь, что пыльца находится в закрывающемся пакете для образцов (рисунок 4).
6. Безопасно отпустите образец рядом с первоначальной точкой захвата.
7. Плотно закройте закрывающийся пакет с образцом пыльцы, в котором находится образец пыльцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в закрывающемся пакете для образцов было вырезано отверстие, его следует поместить в другой закрывающийся пакет для образцов, чтобы избежать загрязнения или потери пыльцы.
8. Наклейте на закрывающийся пакет с образцами уникальный идентификатор образца, соответствующий отдельному насекомому, и другие данные (например, идентификатор вида насекомого, дата, место, время, пол, запись о посещении цветов и т. д.).
9. Поместите закрывающийся пакет для образцов с образцом пыльцы в надежный контейнер, в идеале в более прохладное место, чтобы защитить его от прямых солнечных лучей и/или экстремальных температур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если это уместно, следуйте протоколам проекта по сохранению пыльцы на местах (например, генетический анализ, морфология пыльцы).

Результаты

Эта методология была использована для трех видов пчел, находящихся под угрозой исчезновения (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana и C. electa) на юго-востоке Соединенных Штатов. На сегодняшний день сотни пчел и ос благополучно собраны и выпущены. Ни одна пчела не погибла при использовании этой методологии; Те из них, которые были обозначены как образцы ваучеров и хранились в качестве новой записи о местонахождении в соответствующем управляющем агентстве, были соответствующим образом принесены в жертву после сбора данных. В таблице 1 показаны различные оцененные морфологические признаки, а также другие количественные данные, которые могут быть собраны с использованием данного протокола 14,32,33,34,35,36.

Рисунок 1: Пример таблицы данных, показывающий данные, которые могут быть собраны в полевых условиях. Конкретные собираемые данные будут варьироваться в зависимости от целей проекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Фотографии в качестве ваучеров. Фотографирование в качестве свидетельства о происшествии имеет важное значение для составления отчетов. Фотографии отличительных опознавательных признаков необходимы, когда несколько видов имеют схожие характеристики. Этот Anthidium maculifrons , найденный во Флориде, может быть отличим от других представителей рода по желтому цвету на его черешке и голове. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Установка отверстия в закрывающемся пакете для образцов. Расположение отверстия в закрывающемся пакете для образцов может быть изменено, чтобы определенные части тела, представляющие интерес, были открыты для фотографий или генетических образцов. На этой составной фотографии (А) голова пчелы, (Б) брюшко и (В) нога выставлены на всеобщее обозрение. Как только пчела оказывается запертой и не может двигаться, она часто отдыхает и может быть размещена для получения макрофотографии. (D) Генетический образец также может быть взят, когда пчела находится в этих положениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Мешок для сбора с пчелой, показывающий один угол по диагонали. Если вы хотите внимательно наблюдать за головой пчелы, разрез на углу пакета будет варьироваться по размеру в зависимости от размера головы пчелы. Пыльца и даже нектарные выделения могут быть найдены в пакете для будущей идентификации пыльцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Изображения закрывающегося пакета для образцов с пчелами. Чтобы избежать укуса во время маркировки пчелы, в мешке можно сделать отверстие, а грудную клетку (А) расположить под отверстием. (Б) В зависимости от размера пчелы, она также может быть отмечена на брюшке. (В) В качестве альтернативы, пчелу можно также выпустить из углового отверстия и сжать в грудной клетке для маркировки. Этот метод может увеличить вероятность укуса, но, по-видимому, сводит к минимуму размазывание ручкой. Уникальная расцветка/нумерация может быть использована для различения людей. (D) Будущие отловленные образцы могут быть быстро и легко сфотографированы через закрывающийся пакет для образцов и выпущены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Морфологические особенности, оцененные с использованием этого протокола. Образцами также можно манипулировать для наблюдения и документирования многочисленных признаков, не представленных в этой таблице (например, форма тергита/стернита, общая длина, вес, количество зубцов, жилкование крыльев, межпогулярное расстояние и т. д.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

В этом протоколе изложен полевой метод безопасной обработки и осмотра редких пчел с конечной целью получения желаемого нелетального образца или информации о ваучере и безопасного выпуска очаговых особей обратно в дикую природу в исходной точке поимки. Преимущества этого протокола по сравнению с другими методами сбора, такими как использование флаконов, заключаются в том, что образец может быть безопасно ограничен, что позволяет тщательно изучить ключевые особенности и уверенно идентифицировать, ограничивая вред как для насекомого, так и для исследователя. И наоборот, как и в случае с другими методологиями ^18,19, данный протокол не требует обезболивания образца; Его можно быстро взять и выпустить с минимальными усилиями. Многоразовые пакеты для образцов недороги, просты в приобретении, легки, чрезвычайно портативны и пригодны для вторичной переработки, что делает их отличной альтернативой центрифужным пробиркам. Поскольку им не хватает жесткости некоторых альтернатив (например, соколиных трубок или других жестких контейнеров), важно проявлять особую осторожность при обращении с живыми образцами насекомых. Если в качестве ваучера необходимо взять целый образец, помещение его в прочный корпус уменьшит потенциальное повреждение образца.

Исследователям, использующим этот метод, полезно иметь опыт работы с пчелами и/или другими насекомыми, потому что слишком большое давление на образцы, когда они находятся в мешке, может привести к травме или смерти. Чтобы получить больше опыта работы с пчелами, начинающим исследователям следует практиковать этот протокол на более распространенных видах (например, медоносных пчелах). Практика поможет свести к минимуму травматизм или смертность насекомого. Важно отметить, что в зависимости от фокального таксона у этой методологии могут быть ограничения. Уменьшение размера конкретных таксонов может потребовать использования более дорогостоящего и специализированного оборудования для макросъемки и/или использования полевых микроскопов, поскольку их особенности могут быть не в состоянии быть изолированы и сфотографированы с помощью материалов, перечисленных в данной процедуре, чем меньше мишень, тем труднее может быть получить адекватные^{изображения.} Кроме того, в случаях, когда требуются недоступные части тела (например, язык, гениталии и т. д.), могут быть оправданы другие методы идентификации. Гениталии являются одними из наиболее информативных диагностических признаков для насекомых, которые могут сильно варьировать у разных видов и в некоторой степени стабильны внутри них^38,39. В этом случае могут потребоваться летальные методы, такие как вскрытие. Тем не менее, для трудно идентифицируемых видов использование небольших, нелетальных генетических образцов может быть использовано для идентификации после полевого сбора⁴⁰, и описанная здесь методология может быть использована для сбора таких образцов. Кроме того, разрабатывается статистическое моделирование, которое поможет связать визуализацию и секвенирование ДНК для идентификации насекомых⁴¹.

Еще одно ограничение представленной здесь методики касается вероятности укуса при выполнении этого протокола, особенно при вырезании отверстия в сумке. Этот протокол, однако, сводит к минимуму вероятность укуса; Авторы лишь изредка сталкивались с укусами через мешки с образцами во время работы с образцами. Следует также отметить, что некоторые виды пчел, жуков и ос смогли разрезать пакеты с помощью своих мандибул, поэтому следует проявлять осторожность при определении того, будет ли этот подход работать для интересующих их таксонов, и в этих случаях рекомендуется использовать более толстые пластиковые пакеты или другие методологии. Во всех случаях пользователи должны свести к минимуму использование одноразового пластика и по возможности перерабатывать его.

Основным таксоном для разработки этого протокола была голубая пчела каламинта, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), размер которой составляет примерно 10-11 мм в размере³² мм. С момента разработки этого метода авторы применили его на множестве других перепончатокрылых различных размеров, включая более крупные виды Bombus (Hymnenoptera: Apidae) и виды Caupolicana , C. electa и C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa может варьироваться от 18-23 мм, в то время как C. floridana может варьироваться от 16-18 мм³³. Чтобы свести к минимуму любое негативное воздействие на виды, находящиеся под угрозой исчезновения или занесенные в список, рекомендуется сначала опробовать его на близкородственных и/или общих суррогатных матерях, чтобы помочь получить опыт и повысить квалификацию. Экзоскелет пчел и других насекомых может быть различным, а к менее крепким экземплярам следует относиться бережно. В ситуациях, когда изучаются более мелкие или мягкие тела насекомых, эта методология может оказаться недостаточной. Пользователи должны определить, какие части этой методологии будут подходящими для их фокального таксона.

Помимо основной цели удержания организмов, собранных в полевых условиях, для идентификации, этот протокол может быть изменен для выполнения различных задач, связанных с исследованиями, для выполнения которых пчелы должны быть надежно изолированы. Например, организмы можно взвешивать в полевых условиях, находясь в закрывающихся пакетах для проб. Исследователи также могут проводить различные измерения образцов с помощью штангенциркуля, пока насекомое ограничено. Например, оценка способности пчел к самонаведению может быть сделана с использованием размера тела⁴²; Наша методология может помочь получить данные, которые облегчат такую оценку. Аналогичным образом, вместо использования штангенциркулей исследователи могут разместить и сфотографировать линейку/шкалу и/или цветную карту непосредственно за образцом, чтобы измерить ключевые морфологические особенности при последующей обработке изображений. Будущие приложения этого метода могут использовать достижения в области искусственного интеллекта и машинного обучения. Идентификация, как в полевых условиях, так и в лаборатории, может быть упрощена с помощью интеллектуальных устройств, тем самым сводя к минимуму время обработки и нагрузку на образцы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos