Количественная оценка фенотипов глаз Drosophila melanogaster : вычислительный подход, интегрирующий ilastik и flynotyper

Резюме

Глазная система дрозофилы является полезным инструментом для изучения различных биологических процессов, в частности нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, ручная количественная оценка фенотипов шероховатого глаза может быть предвзятой и ненадежной. Здесь мы опишем метод, с помощью которого ilastik и Flynotyper используются для количественной оценки фенотипа глаза несмещенным образом.

Аннотация

Сложный глаз Drosophila melanogaster представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из около 800 омматидий, демонстрирующих симметричный и шестиугольный рисунок. Такая регулярность и легкость наблюдения делают глазную систему дрозофилы мощным инструментом для моделирования различных нейродегенеративных заболеваний человека. Тем не менее, способы количественной оценки аномальных фенотипов, такие как ручное ранжирование показателей тяжести глаза, имеют ограничения, особенно при ранжировании слабых изменений в морфологии глаза. Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны вычислительные подходы, такие как Flynotyper. Использование кольцевого фонаря позволяет получить более качественные изображения с доступом к целостности отдельных омматидий. Тем не менее, эти изображения не могут быть проанализированы Flynotyper напрямую из-за теней на омматидиях, создаваемых кольцевым светом. В этой статье мы описываем непредвзятый способ количественной оценки фенотипов шероховатости глаз, наблюдаемых в моделях болезни дрозофилы, путем объединения двух программ: ilastik и Flynotyper. Путем предварительной обработки изображений с помощью ilastik можно добиться успешной количественной оценки фенотипа шероховатого глаза с помощью Flynotyper.

Введение

Геном Drosophila melanogaster содержит ~75% ортологов генов, связанных с заболеваниями человека. Кроме того, во время развития глаза дрозофилы экспрессируются примерно две трети генов в геноме, что делает глаз дрозофилы выдающейся генетической системой для исследования различных молекулярных и клеточных функций, развития^{и моделей заболеваний.} Таким образом, глазная система дрозофилы является полезным экспериментальным инструментом для изучения различных биологических процессов.

Сложный глаз дрозофилы представляет собой хорошо структурированный и всеобъемлющий массив из ~800 омматидий, которые демонстрируют симметричный и шестиугольный узор³. Регулярность этого гексагонального рисунка может быть использована для оценки эффекта внесения мутаций и изменений экспрессии генов в^{морфологию глаза}. Предыдущие исследования, которые требовали оценки морфологии глаза, в значительной степени полагались на ручное ранжирование тяжести фенотипов глаз, обнаруженных невооруженным глазом. Для ранжирования фенотипов глаза с помощью стереомикроскопа делают снимки внешней морфологии глаза ^5,6. Фенотип глаза каждой группы оценивается путем разделения наружного глаза на четыре области и расчета доли дегенерации в каждой области ^5,6. Затем значения используются для вычисления средних значений, которые сравниваются со значениями, полученными от контрольных мух⁷. Оценка основана на степени сращения, потере омматидий и организации щетины ^7,8. Фотографии глаз мух, сделанные с помощью стереомикроскопа, получаются одним исследователем, а анализ фенотипа глаза выполняется другим исследователем с помощью тройных наборов^{валидации 7,8}.

Когда дело доходит до ранжирования слабых изменений в морфологии глаза невооруженным глазом, существуют ограничения⁴. Для преодоления этих ограничений^{были разработаны} вычислительные подходы, такие как FLEYE и Flynotyper1,9. Flynotyper — это новый вычислительный метод для количественной оценки морфологических изменений в системе глаза дрозофилы¹. Он автоматически обнаруживает глаз дрозофилы и отдельный омматидий, рассчитывая фенотипические баллы (P-баллы) на основе неровностейглаза¹. Более высокий P-Score указывает на то, что глаз мухи более дегенерирован. Это программное обеспечение было успешно использовано для количественной оценки аномалии глаз дрозофилы ¹⁰. Несмотря на то, что Flynotyper обеспечивает автоматизированный процесс, его все еще нельзя успешно применять к некоторым изображениям глаз, полученным с помощью различных методов световой микроскопии.

Качественно мы отдаем предпочтение кольцевому источнику света по сравнению с одноточечным, так как он обеспечивает более точное представление каждого омматидия. Однако, когда используется кольцевой свет, он создает кольцеобразную тень в верхней части каждого омматидия из-за полусферической формы омматидия. Эта кольцеобразная тень препятствует точному обнаружению омматидии с помощью Flynotyper, что приводит к неправильному расчету P-баллов.

Чтобы решить эти проблемы, мы внедрили ilastik, основанный на машинном обучении инструмент для различных анализов, для классификации омматидий на изображениях глаз мухи¹¹. Затем мы загрузили изображения, сгенерированные ilastik, в Flynotyper для расчета P-оценок. Это позволяет нам непредвзято количественно оценить морфологические дефекты глаз дрозофилы ¹.

протокол

1. Подготовка к количественной оценке

1. Скачайте и установите ilastik¹¹, ImageJ и плагин ImageJ Flynotyper¹. Ссылки на установку на сайте см. в Таблице материалов . Скачивайте соответствующие пакеты в соответствии с операционной системой компьютера (Mac, Windows, Linux и т.д.). Следуйте инструкциям по установке в точности так, как указано.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следование указаниям в точности так, как указано в предоставленных ссылках, является обязательным. Используемый компьютер должен иметь 64-разрядную операционную систему; В остальном других требуемых спецификаций нет. Технические характеристики системы, используемой для этого протокола, см. в Таблице материалов .
2. Используйте стандартное изображение для обучения модели машинного обучения. Сделайте снимок здорового глаза мухи с помощью светового микроскопа с кольцевым светом (например, w1118 x GMR-GAL4), используя центр глаза в качестве фокусной точки. Анализируйте самцов и самок отдельно; Поэтому приобретайте стандартный образ как для самцов, так и для представительниц женского пола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки могут сильно различаться в зависимости от микроскопа и камеры. Смотрите второй абзац обсуждения для получения более общей информации о подготовке к полету и получении изображений.
3. Сделайте снимки экспериментальных глаз мухи с теми же настройками, которые использовались для получения стандартного изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая ориентация имеет первостепенное значение для точной количественной оценки. Смотрите на рисунке 4 в качестве примера для правильной ориентации.

2. Использование ilastik для обнаружения омматидий по изображениям глаз мухи

1. Перед началом анализа убедитесь, что все экспериментальные группы, независимо от условий эксперимента, находятся в одной папке с файлами, чтобы упростить следующие процессы. Убедитесь, что файлы названы правильно, чтобы идентифицировать экспериментальные группы и различать самцов и самок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем распечатать протокол и использовать компьютер для увеличения цифр, так как этот протокол легче всего следовать визуально.
2. Откройте программу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется открывать другие приложения во время работы программного обеспечения; В противном случае компьютер может работать очень медленно, особенно в старых или менее надежных системах.
3. Нажмите на Создать новый проект | Другие рабочие процессы, выберите Cell Density Counting и выберите место для сохранения файла проекта (рисунок 1A).
4. Нажмите на 1. Входные данные | Добавить новый | Добавьте отдельные изображения. Выберите стандартное изображение (рисунок 1B).
5. Нажмите на 2. Выбор функций и выбор используемых функций. Выберите функции, показанные на рисунке 1C; Выберите больше значений сигма для увеличения чувствительности (например, 10, 15, 20 и т. д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечено слишком много флажков, программа может работать в течение длительного времени.
6. Нажмите на 3. Подсчитываем и устанавливаем значение сигмы переднего плана равным 5.00. Отметьте 50 или более отдельных омматидий с помощью инструмента «Передний план » на стандартном изображении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пятидесяти маркировок обычно достаточно для анализа; однако, чем больше омматидий помечено, тем точнее будут результаты (Рисунок 1D).
7. Нажмите на 3. Подсчитываем и с помощью инструмента «Фон» отмечаем внешнюю сторону омматидий (Рисунок 1E). Нарисуйте зеленые линии в форме решетки вокруг омматидии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с большим количеством отметок на омматидии, чем больше зеленых линий нарисовано, тем точнее будут результаты.
8. Нажмите на 4. Экспорт плотности | Выберите «Экспорт настроек изображения», чтобы задать параметры изображения (рисунок 1F). Нажмите на информацию о выходном файле | выберите Формат и tif для дальнейшего анализа в Flynotyper.
9. Нажмите на 5. Пакетная обработка | Выберите Raw Data Files и выберите все экспериментальные фотографии мух для анализа (Рисунок 1G). Список импортированных изображений для анализа приведен в разделе «Выбрать файлы необработанных данных » (рисунок 1H). Нажмите «Обработать все файлы » в нижней части списка 5. Раздел «Пакетная обработка ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Напоминаем, что анализы у мужчин и женщин должны проводиться отдельно. В зависимости от используемого компьютера этот шаг может занять 10 минут или дольше, особенно если импортировано много изображений.
10. После завершения работы программы проверьте ту же папку с файлами, содержащую экспериментальные изображения «глаза мухи»; будут черные изображения с именем "YourSampleName_Probabilities" (Рисунок 1I).

3. Использование ImageJ для подготовки фотографий для Flynotyper

1. Откройте файл .tif, сгенерированный ilastik (черные ящики) в ImageJ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый файл .tif, сгенерированный ilastik, должен обрабатываться отдельно.
2. С помощью инструмента Выделение прямоугольника (Rectangle Select ) создайте прямоугольник вокруг одного глаза. После того, как прямоугольник будет нарисован, обрежьте область, выбрав Ctrl + X или Ctrl + C (рис. 2A). Подождите, пока не появится черный ящик в форме контура прямоугольника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Операционная система компьютера определит, следует ли использовать 'Ctrl + X' или 'Ctrl + C'. Обычно «Ctrl + X» используется для Windows, а «Ctrl + C» — для Mac.
3. Откройте теперь вырезанный глаз мухи с помощью ImageJ; нажмите на Файл | Новое | Внутренний буфер обмена (рис. 2B).
4. Сохраните вырезанный глаз мухи в формате JPEG, нажав на Файл | Сохранить как | Формат JPEG. Вырезанные изображения теперь находятся в той же папке с файлами, что и исходные экспериментальные изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить следующий шаг, рекомендуется создать новую папку с файлами под названием 'cut' и поместить все вырезанные изображения в эту папку.

4. Использование Flynotyper для расчета фенотипических баллов

1. Откройте Flynotyper как плагин ImageJ, нажав на Плагины | Мухомор.
2. Выберите «Добавить генотипы» и откройте папку, содержащую изображения вырезанных глаз мухи (папка с вырезанным файлом). Имя папки появится в разделе Генотипы (рис. 2C).
3. Установите флажки «Световой микроскоп» и «Вертикально», но при необходимости отрегулируйте их соответствующим образом. Отметьте поля Стабильность и расстояние до центра в разделе Ранг Омматидия по: (Рисунок 2C).
4. Для Числа рассмотренных омматидий введите 200.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, 200 - это хорошее число, но корректируйте его в соответствии с предпочтениями.
5. Нажмите кнопку Run и дождитесь появления результатов анализа (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять 5 минут или дольше (или меньше) в зависимости от вычислительной мощности используемого компьютера.
6. Скопируйте и вставьте файл образца и P-Score в статистическое программное обеспечение для дальнейшего анализа.

Результаты

В предыдущем исследовании мы использовали этот протокол для определения генетических модификаторов мутантного белка VCP, связанного с боковым амиотрофическим склерозом с лобно-височной деменцией (БАС-ЛВД)¹². Кроме того, этот метод также был использован в ?...

Обсуждение

Омматидии дрозофил представляют собой полезную систему для изучения различных биологических функций и генетических заболеваний. Регулярность омматидий является хорошим показателем для изучения влияния генетических мутаций⁴. Несмотря на то, что с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.