Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает подход к двухфотонной лазерной абляции, проведенный на личинках рыбок данио, который служит моделью для изучения регенерации костей и эффектов иммунного ответа на абляцию.
Данио рерио (Danio rerio) обладают выдающейся способностью к регенерации различных органов и придатков. Регенерация костей у рыбок данио изучалась с использованием различных методов, таких как ампутация плавников, ощипывание чешуи, трепанация черепа и микроскопические подходы. С использованием конфокальной лазерной сканирующей установки, оснащенной двухфотонным лазером, был разработан метод лазерной абляции в качестве парадигмы поражения для абляции костеобразующих клеток (остеобластов) в развивающейся оперкуле личинок данио-рерио. Описанный здесь метод позволяет проводить точную абляцию клеток, так как площадь, форма и глубина могут быть точно отрегулированы. Кроме того, этот метод позволяет визуализировать область до и сразу после абляции, чтобы можно было проанализировать краткосрочные последствия травмы. В данной экспериментальной установке изучался иммунный ответ после абляции остеобластов в поврежденной области. После абляции наблюдалось увеличение рекрутирования макрофагов, что свидетельствует об актуальности их присутствия при регенерации кости.
Рыбки данио регенерируют различные органы, такие как сетчатка, мозг, сердце и поджелудочная железа1. Кроме того, рыбки данио регенерируют скелетные элементы, поэтому их использовали для изучения регенерации плавников, чешуи и черепных крышек2. Для изучения регенерации тканей и костей использовались различные экспериментальные парадигмы, такие как резекция плавников (ампутация), перелом плавника, трепанация черепа 3,4, криотравма 5,6 или генетическая абляция
Протокол исследования получил одобрение Земельного управления Саксонии, разрешения No 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Используемые штаммы рыбок данио содержались в соответствии с национальным законодательством и в стандартизированных условиях, как описано ранее27,28. Подробная информация обо всех реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка материалов и растворов
Лазерная абляция была выполнена, как указано в протоколе выше. Сигнал GFP остеобластов в абляционной области мгновенно исчезал после абляции. Для изучения реакции абляции остеобластов с точки зрения иммунного ответа было визуализировано присутствие макрофагов в личи.......
Лазерная абляция применяется в различных дисциплинах биологических исследований. В частности, он был полезен в качестве метода для изучения регенерации тканей 10,11,12. Например, рекрутирование и фенотипические измене?.......
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) Transregio 67 (проект 387653785), DFG SPP 2084 μBone (проект KN 1102/2-1) до FK. Эта работа была поддержана Центром световой микроскопии (проект DFG 413875620), основным объектом технологической платформы CMCB в Техническом университете Дрездена. Работа в Техническом университете Дрездена софинансировалась за счет налоговых поступлений из бюджета, утвержденного Саксонским парламентом («Ландтаг»).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O | Carl Roth | 5239.1 | |
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm | Greiner Bio-one | 664160 | |
Dumont #55 Foceps | FST | 11295-51 | Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm |
Falcon 6-well plate | Corning | 353502 | |
Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated |
Insight X3 multiphoton laser | Spectra-Physics | ||
Leica Application Suite | LAS X, Leica Microsystems | ||
Low melting agarose | Biozyme | 840101 | Biozym Plaque Agarose |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M5921 | |
Mating cages | many varieties, e.g. Tecniplast | ||
Methyleneblue | Carl Roth | A514.1 | |
MS-222 | SIGMA Aldrich | A5040 | |
Potassium Chloride, KCl | PanReac AppliChem | 131494 | |
Sodium chloride, NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
SP8 FALCON | Leica Microsystems | Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software | |
Stainless Steel Dissect Needle | Bochem | 12010 | 140 mm |
Stereo Microscope System SZX16 | Olympus | Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ | |
Thermostatic Cabinets TS - WTW | xylem | TS 608/2-i | For incubation (embryo) |
Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 861171 | 155 x 15 mm, LD-PE, transparent |
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0. | Zeiss | Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены