Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает подход к двухфотонной лазерной абляции, проведенный на личинках рыбок данио, который служит моделью для изучения регенерации костей и эффектов иммунного ответа на абляцию.

Аннотация

Данио рерио (Danio rerio) обладают выдающейся способностью к регенерации различных органов и придатков. Регенерация костей у рыбок данио изучалась с использованием различных методов, таких как ампутация плавников, ощипывание чешуи, трепанация черепа и микроскопические подходы. С использованием конфокальной лазерной сканирующей установки, оснащенной двухфотонным лазером, был разработан метод лазерной абляции в качестве парадигмы поражения для абляции костеобразующих клеток (остеобластов) в развивающейся оперкуле личинок данио-рерио. Описанный здесь метод позволяет проводить точную абляцию клеток, так как площадь, форма и глубина могут быть точно отрегулированы. Кроме того, этот метод позволяет визуализировать область до и сразу после абляции, чтобы можно было проанализировать краткосрочные последствия травмы. В данной экспериментальной установке изучался иммунный ответ после абляции остеобластов в поврежденной области. После абляции наблюдалось увеличение рекрутирования макрофагов, что свидетельствует об актуальности их присутствия при регенерации кости.

Введение

Рыбки данио регенерируют различные органы, такие как сетчатка, мозг, сердце и поджелудочная железа1. Кроме того, рыбки данио регенерируют скелетные элементы, поэтому их использовали для изучения регенерации плавников, чешуи и черепных крышек2. Для изучения регенерации тканей и костей использовались различные экспериментальные парадигмы, такие как резекция плавников (ампутация), перелом плавника, трепанация черепа 3,4, криотравма 5,6 или генетическая абляция

протокол

Протокол исследования получил одобрение Земельного управления Саксонии, разрешения No 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Используемые штаммы рыбок данио содержались в соответствии с национальным законодательством и в стандартизированных условиях, как описано ранее27,28. Подробная информация обо всех реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов и растворов

  1. Храните эмбрионы в среде 1x E3. Приготовьте среду 1....

Результаты

Лазерная абляция была выполнена, как указано в протоколе выше. Сигнал GFP остеобластов в абляционной области мгновенно исчезал после абляции. Для изучения реакции абляции остеобластов с точки зрения иммунного ответа было визуализировано присутствие макрофагов в личи.......

Обсуждение

Лазерная абляция применяется в различных дисциплинах биологических исследований. В частности, он был полезен в качестве метода для изучения регенерации тканей 10,11,12. Например, рекрутирование и фенотипические измене?.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) Transregio 67 (проект 387653785), DFG SPP 2084 μBone (проект KN 1102/2-1) до FK. Эта работа была поддержана Центром световой микроскопии (проект DFG 413875620), основным объектом технологической платформы CMCB в Техническом университете Дрездена. Работа в Техническом университете Дрездена софинансировалась за счет налоговых поступлений из бюджета, утвержденного Саксонским парламентом («Ландтаг»).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2OCarl Roth5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plateCorning353502
Glass-bottom microwell dishMatTekP35G-1.5-14-C35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laserSpectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2OSigma-AldrichM5921
Mating cagesmany varieties, e.g. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Potassium Chloride, KClPanReac AppliChem131494
Sodium chloride, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON Leica MicrosystemsEquipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect NeedleBochem12010140 mm
Stereo Microscope System SZX16OlympusEquipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTWxylemTS 608/2-iFor incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.ZeissEquipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware

Ссылки

  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692 (2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Min....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены