Двухфотонная лазерная абляция остеобластов у развивающихся личинок данио-рерио

Резюме

Этот протокол описывает подход к двухфотонной лазерной абляции, проведенный на личинках рыбок данио, который служит моделью для изучения регенерации костей и эффектов иммунного ответа на абляцию.

Аннотация

Данио рерио (Danio rerio) обладают выдающейся способностью к регенерации различных органов и придатков. Регенерация костей у рыбок данио изучалась с использованием различных методов, таких как ампутация плавников, ощипывание чешуи, трепанация черепа и микроскопические подходы. С использованием конфокальной лазерной сканирующей установки, оснащенной двухфотонным лазером, был разработан метод лазерной абляции в качестве парадигмы поражения для абляции костеобразующих клеток (остеобластов) в развивающейся оперкуле личинок данио-рерио. Описанный здесь метод позволяет проводить точную абляцию клеток, так как площадь, форма и глубина могут быть точно отрегулированы. Кроме того, этот метод позволяет визуализировать область до и сразу после абляции, чтобы можно было проанализировать краткосрочные последствия травмы. В данной экспериментальной установке изучался иммунный ответ после абляции остеобластов в поврежденной области. После абляции наблюдалось увеличение рекрутирования макрофагов, что свидетельствует об актуальности их присутствия при регенерации кости.

Введение

Рыбки данио регенерируют различные органы, такие как сетчатка, мозг, сердце и поджелудочная железа¹. Кроме того, рыбки данио регенерируют скелетные элементы, поэтому их использовали для изучения регенерации плавников, чешуи и черепных ^{крышек2.} Для изучения регенерации тканей и костей использовались различные экспериментальные парадигмы, такие как резекция плавников (ампутация), перелом плавника, трепанация черепа ^3,4, криотравма ^5,6 или генетическая абляция

протокол

Протокол исследования получил одобрение Земельного управления Саксонии, разрешения No 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Используемые штаммы рыбок данио содержались в соответствии с национальным законодательством и в стандартизированных условиях, как описано ранее^27,28. Подробная информация обо всех реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов и растворов

1. Храните эмбрионы в среде 1x E3. Приготовьте среду 1....

Результаты

Лазерная абляция была выполнена, как указано в протоколе выше. Сигнал GFP остеобластов в абляционной области мгновенно исчезал после абляции. Для изучения реакции абляции остеобластов с точки зрения иммунного ответа было визуализировано присутствие макрофагов в личи.......

Обсуждение

Лазерная абляция применяется в различных дисциплинах биологических исследований. В частности, он был полезен в качестве метода для изучения регенерации тканей 10,11,12. Например, рекрутирование и фенотипические измене?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware