Визуализация кальция в отдельных клетках для изучения активации ионных каналов кальция

Резюме

В данной статье представлен метод количественного мониторинга концентраций ионов кальция (Ca²⁺) в клетках в режиме реального времени с помощью визуализации Ca²⁺ в одиночных клетках с помощью красителя Fura-2/AM. Этот метод обеспечивает эффективную загрузку красителя и точный расчет уровней^Ca2+ с помощью соотношений интенсивности флуоресценции, что делает его простым и быстрым подходом для исследовательских применений.

Аннотация

Визуализация Ca²⁺ в одиночных клетках имеет важное значение для изучения каналов Ca²⁺ , активируемых различными воздействиями, такими как температура, напряжение, нативное соединение, химические вещества и т. д. В первую очередь он опирается на технологию микроскопии и связанный с ней индикатор Ca²⁺ Fura-2/AM (AM — это аббревиатура от ацетоксиметилового эфира). Внутри клеток Fura-2/AM гидролизуется эстеразами в Fura-2, который может обратимо связываться со свободным цитоплазматическим Ca²⁺. Максимальная длина волны возбуждения смещается от 380 нм до 340 нм (при насыщении Ca²⁺) при связывании. Интенсивность излучаемой флуоресценции количественно связана с концентрацией связанного Ca²⁺. Измеряя соотношение 340/380, можно определить концентрацию Ca²⁺ в цитоплазме, что исключает ошибки, вызванные различиями в эффективности загрузки флуоресцентного зонда среди различных образцов. Эта технология позволяет проводить количественный и одновременный мониторинг изменений^Ca2+ в нескольких клетках в режиме реального времени. Результаты сохраняются в формате ". XLSX» для последующего анализа, который является быстрым и генерирует интуитивно понятные кривые изменений, значительно повышая эффективность обнаружения. С различных экспериментальных точек зрения в этой статье перечислено использование этой технологии для обнаружения сигналов Ca²⁺ в клетках с эндогенными или сверхэкспрессированными белками канала. Между тем, были также показаны и сравнены различные методы активации клеток. Цель состоит в том, чтобы дать читателям более четкое представление об использовании и применении визуализации одиночных клеток Ca²⁺ .

Введение

Ca²⁺ играет решающую роль в передаче клеточного сигнала, регулируя различные клеточные функции, такие как сокращение мышц¹, нервная проводимость², секреция³ и экспрессия генов⁴, тем самым влияя на многочисленные физиологические процессы. Аномальные концентрации Ca²⁺ могут привести к таким заболеваниям, как аритмии⁵, нарушения свертываемости крови⁶ и гормональный дисбаланс⁷. Поэтому изучение механизмов внутриклеточного изменения концентрации^Са2+ имеет первостепенное значение.

В регуляции концентрации^Ca2+ в клетках участвуют различные ионные каналы, в том^{числе каналы 8} с высоким уровнем Ca^+-селективного высвобождения кальция (CRAC) и неселективные катионные каналы семейства TRP⁹. Эти ионные каналы могут быть активированы такими стимулами, как температура¹⁰, соединения и активные ингредиенты, обнаруженные в традиционной китайской медицине¹¹, играя решающую роль в различных физиологических процессах, связанных с^Ca2+.

Эффективный мониторинг внутриклеточных изменений концентрации^Ca2+ имеет важное значение для изучения ионных каналов, связанных с^Ca2+, особенно в области традиционной китайской медицины, где регуляция передачи сигналов кальция играет центральную роль во многих терапевтических подходах. В настоящее время основные методы измерения внутриклеточного Ca2⁺ можно разделить на два типа: электрические и оптические измерения. Подход к электрическим измерениям использует метод патч-зажима для оценки изменений потенциала клеточной мембраны из-за притока Ca^{2+ 12}.

При оптических измерениях флуоресцентные зонды специфически связываются с Ca²⁺, что позволяет исследователям отслеживать изменения интенсивности клеточной флуоресценции. К распространенным оптическим методам относятся методы на основе флуоресцентных белков и флуоресцентных красителей. В методах, основанных на флуоресцентных белках, исследователи могут сверхэкспрессировать чувствительные к^Ca2+ флуоресцентные белки, такие как Cameleon¹³ и GCaMP¹⁴ , в клетках и отслеживать изменения флуоресцентного сигнала с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии для наблюдения за сдвигами в концентрациях Ca²⁺ в цитоплазме. Кроме того, исследователи могут сверхэкспрессировать эти белки у мышей и использовать двухфотонную флуоресцентную микроскопию для мониторинга внутриклеточных концентраций^Ca2+ in vivo в режиме реального времени in vivo или на уровне тканей, обеспечивая высокое разрешение и^{глубокое проникновение} в ткани.

Для методов на основе флуоресцентных красителей обычно используются зонды Ca²⁺ Fluo-3/AM, Fluo-4/AM и Fura-2/AM¹⁰. Исследователи инкубируют клетки в растворе, содержащем эти флуоресцентные зонды, которые пересекают клеточную мембрану и расщепляются внутриклеточными эстеразами с образованием активных соединений (например, Fluo-3, Fluo-4 и Fura-2), которые остаются внутри клетки. Эти зонды проявляют минимальную флуоресценцию в своей свободной лигандной форме, но излучают сильную флуоресценцию при связывании с внутриклеточным Ca²⁺, тем самым указывая на изменения цитоплазматических концентраций Ca²⁺ . По сравнению с другими флуоресцентными белками и красителями, Fura-2 обычно возбуждается на длинах волн 340 нм и 380 нм. При связывании с внутриклеточным свободным^Ca2+ Fura-2 претерпевает сдвиг поглощения, сдвигая пик длины волны возбуждения с 380 нм до 340 нм, в то время как пик излучения около 510 нм остается неизменным. Существует количественная зависимость между интенсивностью флуоресценции и связанной концентрацией Ca²⁺ , что позволяет рассчитать внутриклеточную концентрацию Ca²⁺ путем измерения отношения интенсивности флуоресценции на этих двух длинах волн возбуждения. Измерения соотношения уменьшают последствия фотообесцвечивания, утечки флуоресцентного зонда, неравномерной нагрузки и разницы в толщине ячейки, что позволяет получить более надежные и воспроизводимые результаты (Рисунок 1).

В системах визуализации Ca²⁺ для отдельных клеток в основном используются методы микроскопии и индикатор Ca²⁺ Fura-2/AM для обнаружения внутриклеточных концентраций Ca²⁺ . Эти системы включают в себя флуоресцентный микроскоп, источник света для визуализации Ca²⁺ и программное обеспечение для флуоресцентной визуализации, позволяющее в режиме реального времени проводить количественный мониторинг изменений Ca²⁺ в цитоплазме нескольких клеток одновременно (до 50 клеток в поле зрения). Результаты сохраняются в формате «.xlsx» для последующего анализа. Система обеспечивает быструю скорость анализа (примерно 1 минута для анализа группы клеток в одном поле зрения) и генерирует интуитивно понятные кривые изменений, значительно повышая эффективность обнаружения. Визуализация Ca²⁺ в одиночных клетках является важным техническим подходом к изучению каналов, связанных с Ca²⁺, и имеет большое значение в биомедицинских исследованиях, связанных с ионными каналами. Ожидается, что его применение в технологии визуализации кальция одиночных клеток значительно продвинет вперед исследования механизмов, лежащих в основе традиционной китайской медицины.

протокол

Экспериментальные методы были одобрены и соответствовали рекомендациям IACUC Университета Цинхуа и Пекинского университета китайской медицины. Этот протокол вводит методы визуализации одиночных клеток Ca²⁺ для различных типов клеток, включая первичные кератиноциты, выделенные из кожи нескольких новорожденных мышей (в течение трех дней после рождения, с однопометниками, рандомизированными по полу, мышами C57BL/6). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

ЗАМЕТКА: Первичные клетки, клеточные линии с эндогенными генами-мишенями или клетки, трансфицированные сверхэкспрессированными плазмидами, подходят для визуализации одиночных клеток Ca²⁺ . Плазмиды, использованные в этом исследовании, были получены в лаборатории профессора Сяо Байлуна в Университете Цинхуа. Эти плазмиды были сконструированы путем включения последовательностей флуоресцентного белка GFP с человеческим STIM1, флуоресцентного белка DsRed с человеческим Orai1, флуоресцентного белка mRuby с кроличьим TRPV1, а также красного флуоресцентного белка mCherry в фаговые плазмидные векторы¹⁰.

1. Подготовьте стерильные предметные стекла диаметром 8 мм в 24-луночном планшете. Добавьте в каждую лунку по 500 мкл буфера поли-D-лизина (PDL) (50 мкг/мл в DPBS).
2. Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 °C в течение 1 часа, чтобы обеспечить покрытие, затем слейте раствор для покрытия с помощью пипетки.
3. Вымойте слайды один раз с помощью DPBS и отложите их для последующего использования.
4. Культивирование первичных клеток и клеточных линий отдельно в соответствии с их конкретными методами культивирования¹⁰.
5. Затравливайте клетки на подготовленный 24-луночный планшет с плотностью примерно 1,5 х 10 по⁵ клеток на лунку. Используйте элементы для визуализации Ca²⁺ после того, как они прилипнут к покровному стеколу.
6. Для клеток с гиперэкспрессией плазмид трансфектируют^10,15 плазмиду-мишень (1 мкг/лунку) с помощью реагента для трансфекции Lipofectamine 2000 (или Lipofectamine 3000) в соотношении 1:1 и инкубируют в инкубаторе для клеточных культур в течение примерно 24 ч.
   ЗАМЕТКА: Для более крупных экспрессированных белков может потребоваться более длительное время инкубации.

2. Приготовление рабочего раствора Фура-2/АМ

1. Добавьте 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в пробирку, содержащую 50 мкг порошка Фура-2/АМ, и хорошо перемешайте до получения стокового раствора Фура-2/АМ в концентрации 1 мкг/мкл.
2. Смешайте стоковый раствор Fura-2/AM и Pluronic F-127 в буфере Хэнка, содержащем 1,3 мМ Ca²⁺.
   ЗАМЕТКА: Конечная концентрация Фура-2/АМ и Плуроновой Ф-127 в рабочем растворе составляет 2,5 мкг/мл. Буфер Хэнка получают путем добавления 10 мМ HEPES к 1x HBSS буферу.
3. Используйте алюминиевую фольгу для защиты рабочего раствора Фура-2/АМ от света.

3. Предварительная обработка клеток для визуализации одиночных клеток Ca²⁺

1. Перенесите предметные стекла с ячейками на новую 24-луночную пластину, содержащую буфер Хэнка для промывки.
2. Выбросьте буфер с помощью пипетки и добавьте в каждую лунку по 500 мкл рабочего буфера Fura-2/AM.
3. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут, чтобы обеспечить загрузку зонда.
4. Снимите рабочий буфер Фура-2/АМ и трижды промойте ячейки буфером Хэнка, чтобы удалить излишки Фура-2/АМ. Теперь элементы готовы к использованию.

4. Запуск системы визуализации Ca²⁺

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании для визуализации Ca²⁺ используется флуоресцентный микроскоп.

1. Последовательно запускайте следующие компоненты: источник света DG4 (ксеноновая лампа), камера, источник белого света, контроллер предметного стекла микроскопа, микроскоп, компьютер и программное обеспечение для флуоресцентной визуализации.
   ЗАМЕТКА: При обнаружении активации ионных каналов по температуре также включите следующие компоненты: систему перфузии, систему нагрева, регулятор температуры, устройство нагрева/охлаждения с циркуляцией жидкости.

5. Процедура реакции клеточного Ca²⁺

1. Откройте программное обеспечение для флуоресцентной визуализации (см. Таблицу материалов).
   1. Выберите «Протокол», затем выберите «Файл», а затем «Загрузить протокол». Выберите протокол и нажмите кнопку «ОК».
   2. Настройте эксперимент (в списке меню).
   3. Выберите Новый эксперимент.
2. Установите перфузионную камеру на микроскоп.
   ЗАМЕТКА: Всегда полностью опускайте объектив при установке или снятии камер с помощью грубой ручки фокусировки, чтобы не повредить объектив.
3. Снимите предметные стекла, обработанные Фура-2/АМ, и поместите их в камеру, содержащую буфер Хэнка.
4. Запустите систему перфузии.
5. Выберите объектив DIC с 20-кратным увеличением и отрегулируйте фокусировку при белом свете.
6. Нажмите на Cfg Exp на панели задач.
   1. Выберите нужные флюоры для визуализации.
   2. Определение частоты сбора данных и отображения настроек на экране (Сбор: проверка на 340, 380, GFP; Интервал захвата: 1 с; Интервал сохранения: 1 с).
7. Фокус
   1. На панели управления экспериментом нажмите на кнопку Фокус .
   2. Отрегулируйте время захвата (обычно 100 мс) и усиление по мере необходимости, а затем «сохраните для этой волны».
      ЗАМЕТКА: Для ультрафиолетового излучения используйте усиление, а не время экспозиции.
   3. Выберите желаемую длину волны для фокусировки (например, 380) и нажмите на кнопку «Начать фокусировку».
   4. Переключите вид с бинокля на компьютер.
   5. Убедитесь, что в бинокль виден слабый зеленоватый цвет.
   6. Сосредоточьтесь на ячейках, используя сначала грубый фокус, чтобы приблизить объектив, а затем точный фокус.
      ЗАМЕТКА: Микроскоп издаст звуковой сигнал, если подойдет слишком близко к сцене. Если это произошло, опустите объектив, снова выровняйте пластину на рабочей области и снова сосредоточьтесь. Сведите к минимуму время, затрачиваемое на фокусировку, чтобы уменьшить повреждение клеток, вызванное лазером.
   7. Проверьте интенсивность флуоресценции клеток в процессе фокусировки.
   8. Отрегулируйте интенсивность флуоресценции клеток, изменяя время воздействия и усиление.
      ЗАМЕТКА: Время экспозиции и усиление для 340 и 380 должны быть постоянными.
   9. Как только будет достигнута хорошая фокусировка, нажмите кнопку на микроскопе, чтобы переключить изображение на компьютер.
   10. При необходимости измените фокусировку, чтобы получить наиболее четкое изображение на компьютере, затем нажмите « Остановить фокусировку».
8. Альтернативная процедура поиска GFP-положительных клеток
   1. Сначала используйте процедуру 340/380, чтобы добиться хорошей фокусировки на клетках.
   2. Выберите FITC и нажмите « Начать фокусировку».
   3. Используйте контроллер рабочей области для поиска GFP-положительных клеток.
   4. Переключите вид на компьютер и нажмите « Остановить фокусировку».
9. Выбор региона
   1. Нажмите кнопку « Регион » в строке меню.
   2. Выберите тип подсветки (340/380/FITC/TRITC). фильтры FITC и TRITC выбраны для GFP и mCherry/DsRed/mRuby, соответственно, для клеток, гиперэкспрессирующих целевые плазмиды; в противном случае выберите Fura-2.
      ЗАМЕТКА: Избегайте выбора клеток, которые находятся в плохом состоянии или мертвы, например, тех, которые явно округлые или имеют чрезмерное воздействие флуоресцентных белков.
   3. Нажмите «Получить изображения», затем OK.
   4. Появится новое окно; Выделите ячейки, нажав на инструмент «Овал », а затем щелкнув по ячейке.
   5. Выберите нужные клетки под флуоресценцией, переносимой белком-мишенью (FITC или TRITC). Выберите контрольные клетки, которые не экспрессируют целевой белок при условии 380 нм.
   6. Отмените регион, щелкнув правой кнопкой мыши по кругу и выбрав «Удалить регион».
   7. Выберите фоновый образец в качестве последнего региона и запишите его идентификационный номер.
   8. Нажмите « Сохранить », а затем «Готово».
10. Вычитание фона
    1. Нажмите на кнопку меню «Ссылки».
    2. Укажите номер фоновой области.
       ЗАМЕТКА: Если фон был выбран последним, то при вводе очень большого числа автоматически произойдет переключение на последний выбранный регион.
    3. Поставьте галочку в окошке «Вычесть ссылки» и нажмите «ОК».
11. Данные журнала
    1. Нажмите на кнопку «Регистрировать данные » на панели управления экспериментом.
       ЗАМЕТКА: Изображения сохраняются только в том случае, если есть желание повторить эксперимент позже; Как правило, достаточно просто поставить галочку в поле данных.
    2. Убедитесь, что появляется запрос на выбор предпочтительного типа файла данных; Выбор. Рекомендуется формат XLSX .
    3. Откроется лист типа ".xlsx". Сворачивание листа не позволит ему занимать место на экране.
12. Сбор данных
    1. В разделе Time Lapse панели управления установите интервал сбора данных равным 1 с.
       ЗАМЕТКА: Это может быть скорректировано в соответствии с фактическими потребностями.
    2. Нажмите Zero Clock и Acquire на панели управления экспериментом, чтобы начать эксперимент. Базовые линии будут видны на графике с указанием каждой из выбранных областей ячеек.
    3. Проведите ряд обработок клеток в соответствии с экспериментальными требованиями.
    4. Чтобы наблюдать за температурной реакцией клеток, нагрейте буфер в системе перфузии до соответствующей температуры с помощью терморегулятора.
    5. Чтобы наблюдать за воздействием лекарственных препаратов на клетки, проведите перфузию или вручную добавьте препаратосодержащий буфер и зарегистрируйте изменения в клетках.
    6. После завершения сбора данных нажмите «Пауза».
       ЗАМЕТКА: Сбор данных может быть приостановлен, а часы могут быть сброшены в любое время во время эксперимента.
    7. Сохраняйте и анализируйте данные.
13. Нажмите « Файл » и «Закрыть эксперимент », чтобы завершить эксперимент, и выберите «Нет » в диалоговом окне, чтобы сохранить протокол.
14. Откройте новый эксперимент, нажав « Создать » в меню, и повторите процесс.
15. Отключение
    1. Закройте программное обеспечение и перенесите данные с компьютера.
    2. Отмените процедуру запуска.
    3. Запишите часы работы в листе регистрации и уберите весь беспорядок.
16. Анализ данных
    1. Представляйте внутриклеточную концентрацию Ca²⁺ в соотношении Fura-2 340/380 или преобразуйте в соответствующую концентрацию Ca²⁺ .

Результаты

Обнаружение температурной реакции
Первичный кератиноцит
Первичные кератиноциты выделяли от новорожденных мышей и готовили в соответствии с установленными протоколами¹⁰. Эти ячейки были засеяны в 24-луночные планшеты, содержащие стекля...

Обсуждение

Системы визуализации Ca²⁺ для отдельных клеток широко распространены, что позволяет изучать сигналы Ca²⁺ в различных типах клеток, включая кератиноциты, стволовые клетки¹⁶, клетки печени, клетки сердца¹⁷, подоциты¹⁸, иммун?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon