JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В эксперименте, использованном здесь, показан метод молекулярного докинга в сочетании с зондовыми технологиями для прогнозирования и проверки взаимодействия между малыми молекулами традиционной китайской медицины и белковыми мишенями.

Аннотация

Деубиквитинирующие ферменты (ДАБ) играют ключевую роль в модуляции убиквитинирующего гомеостаза, при этом UCHL3 является архетипическим цистеиновым ДАБ, сложным образом участвующим во множестве физиологических и патологических процессов. Поэтому разработка низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на убиквитин С-концевую гидролазу L3 (UCHL3), имеет большое значение. Этот протокол направлен на создание процесса виртуального скрининга и валидации in vitro низкомолекулярных ингибиторов цистеина DUB, представленных UCHL3. Во-первых, потенциальные ингибиторы UCHL3 виртуально проверяются с помощью технологии молекулярного докинга, и визуализируется взаимодействие между препаратами и белковыми мишенями. Впоследствии эффективность скринингового препарата Danshensu проверяется с помощью анализов ингибирования активности in vitro . Убиквитин-7-амино-4-метилкумарин (Ub-AMC) и гемагглютинин-убиквитин-винилсульфон (HA-Ub-VS) используются в качестве зондов для тестирования активности in vitro , поскольку они могут конкурентно связываться с DUB с низкомолекулярными ингибиторами для оценки активности UCHL3. Результаты показывают, что Danshensu обладает хорошим сродством связывания с UCHL3 в молекулярном докинге и может конкурентно ингибировать активность UCHL3 с HA-Ub-VS. Эти результаты являются важными источниками для дальнейших исследований и разработки терапевтических препаратов, нацеленных на UCHL3.

Введение

Убиквитинация — это посттрансляционная модификация белков, процесс, при котором ферменты, активирующие убиквитин E1, убиквитин-конъюгирующие ферменты E2 и убиквитин-лигазы E3 присоединяют убиквитин к белку-мишени, и весь процесс убиквитинирования может быть обращен вспять с помощью деубиквитинирующих ферментов (DUB)1,2,3,4. Благодаря своей важной физиологической и патологической роли, DUB считаются важными мишенями для разработки лекарств 5,6.

У человека выявлено более 100 DUB 7,8. Обычно они функционируют как изопептидаза, ответственная за расщепление изопептидной связи между С-концом убиквитина и остатком лизина в субстрате или другой молекуле убиквитина 9,10. В настоящее время они в основном классифицируются на семь основных семейств, а именно: убиквитин-специфические пептидазы (USP), протеазы опухолей яичников (OTU), N-концевые + доменные протеазы Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 (JAMM), мотивы, взаимодействующие с убиквитин-содержащими протеазами нового семейства DUB (MINDYs), убиквитин-C-концевые гидроксилазы (UCHs), протеазы домена Мачадо-Жозефина (MJD) и убиквитин-пептидаза 1, содержащая цинковые пальцы (ZUP1)9. В дополнение к JAMM, которые принадлежат к семейству металлопротеаз цинка11, другие DUB представляют собой цистеиновые протеазы, характеризующиеся каталитической триадой, состоящей из каталитического цистеина, гистидина и третьего кислотного остатка 12,13. Эта специфичность открывает возможности для разработки низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на активный центр фермента или близлежащие аллостерические карманы.

В области исследования деубиквитинирующих ферментов существует значительная проблема в характеристике их активности14,15. Определение характеристик на основе активных зондов служит ключевым подходом к изучению ингибиторов DUB16. Выполняя конкурентные анализы с помощью зондов и ингибиторов, основанных на активности, в клеточных лизатах или рекомбинантных белках, можно охарактеризовать активность DUB, способствуя разработке низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на эти ферменты. Ub-AMC — это ранний зонд, используемый для обнаружения активности DUB, который имеет флуоресцентную группу, прикрепленную к С-концевому концу убиквитина17,18. Когда DUB проявляют свою каталитическую активность, AMC высвобождается в больших количествах, и интенсивность флуоресцентного света регистрируемого им света соответственно увеличивается. Этот зонд широко используется для высокопроизводительного скрининга ингибиторов DUB19,20. Зонд HA-Ub-VS также используется для измерения активности DUB21. Он имеет винилсульфоновую группу на С-конце убиквитина, что делает его субстратом самоубийства для DUB. После разделения гелевым электрофорезом додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) активные DUB могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга 22,23,24.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) использует лекарственные растения уже более 2000 лет. Разработка новых лекарств из натуральных продуктов имеет большое медицинское значение, при этом основное внимание уделяется идентификации активных ингредиентов и выяснению механизмов их действия. Шалфей милтиорриза Bge - это трава, широко используемая при лечении различных заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые, печеночные и неврологические26. В настоящее время он содержит известные малые молекулы, такие как таншинон27, даньшенсу28, таншиновая кислота29 и т.д. Эти соединения проявляют разнообразную биологическую активность, такую как антитромботическое, антиоксидантное и противоопухолевое действие, что делает их очень ценнымидля исследований. Недавние исследования идентифицировали Danshensu как ковалентный ингибитор 3-химотрипсин-подобной протеазы (3CLpro) SARS-CoV-230. Было показано, что он образует ковалентную связь с остатком активного центра C145 3CLpro, что указывает на присутствие потенциальных низкомолекулярных ингибиторов протеазы в Salvia miltiorrhiza Bge.

Убиквитин С-концевая гидролаза L3 (UCHL3) принадлежит к цистеиновым протеазам семейства UCH DUB. Он полагается на консервативные остатки, такие как цистеин95, гистидин169 и аспарагиновая кислота184, для эффективного катализа своих функций31,32. Он играет решающую роль во многих молекулярных путях, включая клеточный цикл, гомологическую рекомбинацию и репарацию разрывов ДНК, связанных с белками. Кроме того, он повышен при различных видах рака, таких как рак яичников, предстательной железы, поджелудочной железы, толстой кишки и немелкоклеточный рак легких34. Основываясь на этих исследованиях, UCHL3 представляется перспективной мишенью для лечения заболеваний. Несколько низкомолекулярных ингибиторов UCHL3 были идентифицированы и в настоящее время находятся на стадии клинического применения35,36.

В этом исследовании был проведен молекулярный докинг для изучения взаимодействий между малыми молекулами Salvia miltiorrhiza Bge и UCHL3. Впоследствии эксперимент in vitro с использованием специфичных для DUB зондов Ub-AMC и HA-Ub-VS идентифицировал Danshensu как низкомолекулярный ингибитор UCHL3. Молекулярный докинг также предсказывал потенциальные сайты связывания для Danshensu, предполагая механизм его действия.

протокол

1. Загрузка структур малых молекул Salvia miltiorrhiza Bge и UCHL3

  1. Скачайте файл с малыми молекулами.
    1. Откройте базу данных TCMSP (https://old.tcmsp-e.com), введите даньшэнь (название травы), затем нажмите поиск и нажмите на Radix Salviae в списке результатов.
    2. Нажмите на «Скачать один за другим» и сохраните 2D-структуру в формате .mol2.
  2. Скачайте файл с белком.
    1. Откройте базу данных PDB (https://www.rcsb.org/), введите UCHL3 и нажмите кнопку поиска. Нажмите Homo sapiens, затем нажмите «Поиск » в уточнениях.
    2. Выберите структуру 1XD3 с сокристаллизацией малых молекул и белка, затем нажмите «Загрузить файлы» и выберите формат PDB .

2. Молекулярный докинг

  1. Сохраните файл.
    1. Создайте новую папку с именем danshen_UCHL3 docking на рабочем столе и сохраните в ней составы структур Salvia miltiorrhiza Bge и UCHL3. Назовите папку на английском языке; В противном случае файл не будет импортирован.
  2. Задайте контур.
    1. Откройте программное обеспечение Maestro, нажмите «Файл», выберите «Изменить рабочий каталог», нажмите «Рабочий стол», дважды щелкните, чтобы выбрать папку danshen_CUHL3 закрепления, и нажмите «Выбрать параметры».
  3. Обработка малых молекул
    1. Импортируйте низкомолекулярные структуры.
      1. Нажмите Параметры файла и импорта структур. Нажмите «Рабочий стол», дважды щелкните папку стыковки и щелкните файл структуры Salvia miltiorrhiza Bge. Затем нажмите кнопку «Открыть», чтобы импортировать все малые молекулы.
    2. Подготовьте маленькую молекулу.
      1. Нажмите «Задачи» и выберите опцию «LigPrep». В открывшемся окне LigPrep нажмите на таблицу проекта по опции Использовать структуру из, отметьте галочкой опцию Определить хиральности из 3D-структуры в разделе расчет и оставьте все остальные настройки программного обеспечения по умолчанию.
      2. Измените имя задания на danshen_ligprep1, а затем нажмите кнопку Выполнить , чтобы выполнить обработку малых молекул.
  4. Обработка структуры белка
    1. Импортируйте структуру белка.
      1. Нажмите на опции «Файл » и «Импорт структур », нажмите «Рабочий стол » и дважды щелкните по папке закрепления danshen_CUHL3.
      2. Щелкните файл структуры белка UCHL3 , а затем нажмите кнопку Открыть , чтобы импортировать файл структуры белка.
    2. Подготовьте белок.
      1. Выделите две ковалентные связи, соединяющие UCHL3 и малую молекулу, и удалите их с помощью кнопки Delete. Затем выберите два белковых остатка, которые являются неполными после делеции. Нажмите кнопку Build, выберите Other edits, а затем для Gly75 нажмите кнопку C, для Cys95 выберите Mutate Residue и CYS.
      2. Нажмите «Задачи» и выберите параметр «Рабочий процесс приготовления белка ». Оставьте все остальные настройки программного обеспечения по умолчанию. Измените имя задания на UCHL3_protein pre, затем нажмите кнопку Выполнить , чтобы выполнить обработку белка.
    3. Установите док-станцию.
      1. Нажмите « Задачи», выберите «Генерация рецепторной решетки» и выберите «Выбрать», чтобы идентифицировать молекулу лиганда . Выберите малую молекулу в рабочей зоне e, и появится розовая стыковочная рамка с центром по координатам малой молекулы.
      2. Сохраните настройки по умолчанию, присвойте заданию имя 1XD3_danshen_glide_grid и нажмите кнопку Выполнить.
        Примечание: В 1XD3 маленькая молекула образует ковалентную связь с белком. Необходимо удалить эту ковалентную связь, чтобы отделить маленькую молекулу от белка. В противном случае, в процессе настройки рецепторной решетки, малая молекула не может быть выбрана.
  5. Выполните молекулярный докинг.
    1. Нажмите «Задачи» и выберите параметр «Стыковка лигандов». Выберите сетку рецепторов, нажмите «Из файла», а затем нажмите «Обзор». Выберите 1XD3_danshen_glide_grid.zip файл и нажмите кнопку Открыть.
    2. Нажмите «Использовать лиганды из как файлы», затем нажмите «Обзор». Щелкните danshen_ligprep1 файл, выберите файл danshen_ligprep1-out. maegz, а затем нажмите кнопку Открыть.
    3. Нажмите «Настройки» и выберите параметр «Точность как SP », измените имя задания на danshen_UCHL3_ glidedock _SP и нажмите «Выполнить».
  6. Просмотрите результаты стыковки.
    1. Нажмите Параметры файла и импорта структур . Нажмите «Рабочий стол » и дважды щелкните папку danshen_CUHL3 закрепления.
    2. Дважды щелкните файл _SP danshen_UCHL3_ glidedock , щелкните файл danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz , а затем нажмите «Открыть».
    3. Выберите параметр «Таблица », а затем просмотрите счет в разделе «Оценка стыковки».
  7. Визуализируйте взаимодействие danshensu и UCHL3.
    1. Дважды щелкните файл danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz и откройте его в Maestro. В списке записей зажмите Shift и одновременно выберите даншэнсу и белок.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите « Объединить », чтобы создать новую структуру. Выберите новую структуру, щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Экспорт», затем нажмите «Структуры», назовите файл danshensu_UCHL3 и экспортируйте его в формате .pdb.
    3. Выберите структуру слияния на панели, нажмите «Задачи», выберите «2D-эскиз» и получите 2D-картину взаимодействия между danshensu и UCHL3.
    4. Импортируйте файл danshensu_UCHL3.pdb в программу pymol и визуализируйте на основе 2D-структуры, полученной от Maestro.

3. Очистка белка UCHL3

  1. Построение плазмиды экспрессии прокариот pHUE-UCHL3
    1. Получить кодирующую последовательность гена рекомбинантного белка UCHL3 из NCBI (isform2). Интегрировать полученный фрагмент гена в вектор pHUE-10HIS путем гомологичной рекомбинации и трансформировать его в DH5α-компетентные клетки. Извлеките плазмидную ДНК для получения желаемой конструкции.
  2. Индукция и очистка рекомбинантных белков
    1. Бактериальный посев:
      1. Трансформируйте рекомбинантные плазмиды в компетентные клетки BL21 (DE3) и распределите их на агаровых пластинах Лурия-Бертани (LB), содержащих ампициллин. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи.
      2. Выберите одиночные колонии, инокулируйте их в 12 мл жидкой среды LB с добавлением ампициллина 50 мкг/мл и закваливайте в течение ночи при 37 °C.
    2. Трансформация и индукция
      1. Разбавьте за ночь бактериальную культуру до 2% с помощью свежей среды. Когда OD600 достигнет 0,4-0,6, добавьте изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,4 мМ для низкотемпературной индукции при 16 °C в течение 12 ч.
    3. Сбор бактериального посева
      1. Перенесите бактериальную культуру в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируйте при давлении 2200 x g в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость и храните штаммы при температуре -80 °C для консервации.
    4. Ультразвуковая обработка
      1. Ресуспендируйте штамм в 25 мл (1/20 собранной бактериальной культуры) буфера 1 (50 мМ HEPES pH 7,5, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА). Проводить бактериальную ультразвук при следующих условиях: включено на 4 с, выключено на 6 с, энергия установлена на 60%, на 15 мин. Добавьте 1% Triton X-100 и лизируйте при 4 °C в течение 30-60 минут.
    5. Разделение надосадочной жидкости и гранул
      1. Центрифугируйте образец при давлении 9000 x g при 4 °C в течение 30 минут. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через мембранный фильтр 0,45 мкм. Зарезервируйте 50 мкл надосадочной жидкости в качестве входа.
      2. Повторно суспендируйте гранулу в буфере 1, добавьте соответствующее количество 5-кратного буфера для образца (25% 1М Tris-HCl [pH 6,8], 10% додецилсульфата натрия, 0,5% бромфенола синего, 41,67% глицерина и 10% DL-дитиотреитола) и кипятите при 100 °C в течение 10 минут.
  3. Очистка белка
    1. Уравновешивание столбцов
      1. Загрузите в колонку 1 мл никелевой смолы NiNTA, дайте ей отстояться в течение 10 минут, затем последовательно уравновесьте колонку 5 объемами буфера 2 (50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl), содержащего 10 мМ, 500 мМ и 10 мМ имидазола.
      2. С помощью пипетки добавьте 5 мл (примерно 5 объемов колонки) 10 мМ раствора имидазола вдоль стенки колонки. Выполняйте этот процесс, не контролируя расход.
      3. После того, как жидкость покроет упаковочный материал и почти полностью стечет, последовательно добавьте 5 объемов столбцов раствора имидазола 500 мМ и раствора имидазола 10 мМ для уравновешивания. Когда оставшиеся 10 мМ раствор имидазола покроют упаковочный материал, закройте регулятор потока, чтобы остановить балансировку.
    2. Очистка белка
      1. Пропустите отфильтрованный белковый надосадочный продукт через колонку со скоростью потока 0,5 мл/мин (<15 с на каплю), собирая проточную фракцию. Приготовьте градиент концентрации имидазола 10 мМ, 30 мМ, 50 мМ и 100 мМ с использованием буфера 2 вместе с 0,5 М NaCl.
      2. Разводите последовательно от низких к высоким концентрациям имидазола, с помощью пипетки добавляйте примерно 5 объемов раствора в колонку вдоль стенки колонки, не контролируя скорость потока. Соберите элюат в чистые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, взяв 1 мл проточного потока на пробирку.
      3. После сбора пяти пробирок возьмите 1 мкл проточного потока из каждой пробирки, чтобы вступить в реакцию с 1 мкл буфера Брэдфорда. Если реакция осталась синей, продолжайте действия; Если он становится прозрачным, прекратите элюирование на этой концентрации и переключитесь на следующую.
      4. После элюирования 100 мМ имидазолом промыть 10 колонок объемом 0,5 М NaCl, не контролируя расход и не собирая элюат.
      5. Наконец, выведите 500 мМ имидазола (<15 с на каплю). С помощью пипетки добавьте 1 мл раствора в колонку, поддерживая вышеупомянутую медленную скорость элюирования. Соберите 1 мл элюата с помощью микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл и повторите этот процесс 10 раз.
    3. Оцените очищенный белок с помощью окрашивания Coomassie Brilliant Blue.
      1. Количественно оцените ранее полученную гранулу, надосадочную жидкость предварительной очистки и собранные 10 пробирок с белком, взяв по 10 мкл из каждой группы и добавив соответствующий 5-кратный буфер для пробы, а затем нагрев при 100 °C в течение 5 мин.
      2. Приготовьте стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях 1 мг/мл, 500 мкг/мл и 100 мкг/мл. Затем добавьте соответствующий 5-кратный буфер для образцов и нагревайте при 100 °C в течение 5 минут.
      3. Проведите гель-электрофорез SDS-PAGE на образцах, затем удалите гель и инкубируйте его при комнатной температуре (RT) в растворе Coomassie Brilliant Blue на низкоскоростном шейкере в течение ночи.
      4. На следующий день переложите гель в обесцвечивающий раствор (40% этанол, 10% уксусная кислота, 50% H2O) для обесцвечивания, применяя мягкое нагревание по мере необходимости. Как только гель станет прозрачным, понаблюдайте с помощью прибора для количественного определения очищенного белка на основе уровней BSA и оцените чистоту, проверив наличие одной полосы.
    4. Хранение белка: Аликвотируйте белок в микроцентрифужные пробирки по 50 мкл на пробирку, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.

4. Анализ активности UCHL3 (анализ Ub-AMC)

  1. Приготовление белка
    1. Разморозьте белок на льду, центрифугируйте образец при 1000 x g при RT в течение 3 минут и определите концентрацию белка методом BCA. Разбавьте белок до концентрации 40 нМ с помощью буфера 1.
  2. Настройка групп
    1. Назначьте буфер 1 в качестве контрольной группы, а UCHL3 — в качестве экспериментальной группы. Добавьте 200 мкл каждого образца на лунку в 96-луночный планшет, установив 3 репликации на группу.
  3. Обнаружение
    1. Непосредственно перед измерением быстро добавьте Ub-AMC в каждую лунку и энергично встряхивайте в течение 2-5 секунд. Концентрация используемого Ub-AMC составляет 250 нМ. Измеряйте значения наружного диаметра на длине волны возбуждения 380 нм и длине волны излучения 460 нм при температуре 37 °C, снимая показания каждые 30 с в течение 10 минут.

5. Анализ ингибирования активности UCHL3 с помощью HA-Ub-VS (анализ HA-Ub-VS)

  1. Приготовление белка
    1. Разморозьте белок на льду, центрифугируйте образец при 1000 x g при RT в течение 3 минут и определите концентрацию белка методом BCA. Разбавьте белок до концентрации 10 мкг/мл.
  2. Получение малых молекул
    1. Взвесьте Даньшенсу и разбавьте его градиентом с использованием воды высокой чистоты до 5 мМ, 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ и 1 мкМ.
  3. Настройка групп
    1. Установите группу с чистым белком и группу без низкомолекулярных препаратов в качестве групп отрицательного контроля. Используйте PR619 (ингибитор DUB) в качестве положительной контрольной группы, а остальные группы в качестве групп лечения низкомолекулярными препаратами.
  4. Подготовка образцов
    1. В соответствии с группировкой последовательно добавляйте 9 мкл UCHL3 и 1 мкл Dansensu в соответствующих концентрациях в каждую группу, подвергшуюся медикаментозной обработке. Добавьте 1 мкл PR619 (50 мкМ в использовании) в положительную контрольную группу. Используйте воду высокой чистоты и буфер 1, чтобы компенсировать отрицательную контрольную группу.
    2. Тщательно перемешайте вортексом и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут. Поместите образцы реакции на лед, добавьте HA-Ub-VS до конечной концентрации 1 мкМ, тщательно перемешайте путем вортексирования и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
    3. Добавьте соответствующее количество 5-кратного буфера для образца и нагрейте в металлической ванне при температуре 100 °C в течение 10 минут. Поместите образцы в режим RT на 5 минут и загрузите в гель.

6. Вестерн-блот

  1. Приготовление геля SDS-PAGE
    1. Промойте набор стеклянных панелей сверхчистой водой. Поместите пластины в паз для зажима, затем на прозрачную доску. Добавьте сверхчистую воду и проверьте герметичность в течение 10 минут.
    2. Приготовьте разделительный клей в соответствии с таблицей дозирования клея.
    3. Слейте воду высокой чистоты из гелевой кассеты и впитайте остатки воды с помощью фильтровальной бумаги. Быстро и равномерно добавьте подготовленный 12% разделительный гель. Затем добавьте 1 мл изопропанола и подождите примерно 30 минут, пока гель застынет.
    4. Подготовьте верхний слой концентрированного клея в соответствии с таблицей дозирования клея.
    5. Удалите изопропанол с верхней части разделительного геля, промойте его 3 раза водой высокой чистоты и промокните насухо фильтровальной бумагой. Быстро добавьте приготовленный 3% стекирующий гель, вставьте расческу 1,0 мм с 15 отверстиями и подождите примерно 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите расческу перпендикулярно поверхности клея и следите за тем, чтобы не появлялись пузырьки воздуха.
  2. Электрофорез
    1. Вертикально снимите гребень и залейте достаточное количество проточного буфера во внутреннюю камеру аппарата для электрофореза, следя за тем, чтобы жидкость покрывала лунки образца.
    2. Поместите белковый маркер и подготовленные экспериментальные образцы в RT, тщательно перебейте и кратковременно центрифугируйте. Добавьте 3 мкл белкового маркера в первую лунку для левого образца, а затем по 10 мкл экспериментального образца в каждую последующую лунку.
    3. Добавьте соответствующее количество рабочего буфера во внешнюю камеру бака для электрофореза, накройте бак крышкой и подключите источник питания. Убедитесь, что источник питания подключен правильно.
    4. Включите источник питания и установите напряжение на 80 В, пока образцы не сконцентрируются в линии, затем увеличьте напряжение до 120 В, как только начнется разделение в разделительном геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса следите за тем, чтобы на дне не образовывались пузырьки. Если появились пузырьки, наклоните аппарат для электрофореза в одну сторону, чтобы вытолкнуть их.
  3. Перенос на мембрану
    1. С помощью пластикового ножа откройте гелевую кассету. Отрежьте угол в левом верхнем углу, где началась загрузка образца, чтобы отметить ориентацию. Замочите гель и необходимую фильтровальную бумагу в буфере для переноса на 1-2 минуты.
    2. Измерьте и разрежьте мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) в соответствии с размером, необходимым для целевого белка. Активируйте мембрану из ПВДФ, замочив ее в метаноле на срок от 20 с до 1 минуты, затем погрузите ее вместе с гелем в буфер для переноса.
    3. Залейте небольшое количество буфера в передаточное устройство и с помощью ролика намочите полусухой передаточный узел. Расположите компоненты в следующем порядке снизу вверх: три слоя фильтровальной бумаги, гель, мембрана из ПВДФ и еще три слоя фильтровальной бумаги.
    4. После размещения каждого слоя используйте валик, чтобы удалить любые пузыри. Намочите крышку с помощью буфера для переноса, а затем накройте аппарат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что имеется достаточное количество буфера передачи, добавляя небольшое количество после завершения каждого слоя. Заранее подготовьте маркировку, различающую левую и правую стороны геля, куда были загружены образцы, а также идентифицирующую переднюю и заднюю стороны мембраны. После того, как каждый слой будет нанесен, аккуратно раскатайте, чтобы удалить любые пузыри.
    5. Включите блок питания, убедившись в правильной полярности. Отрегулируйте ток на 190 мА и установите время на 45 минут.
  4. Блокировка
    1. Приготовьте 5% обезжиренный раствор сухого молока в TBST (1% Tween20) в качестве блокирующего буфера. Поместите мембрану PVDF лицевой стороной вверх в коробку для гибридизации, налейте 10 мл блокирующего буфера и осторожно встряхните на низкоскоростном вибростенде при температуре RT в течение 1 часа для блокировки.
  5. Инкубация первичного антитела
    1. Приготовьте первичное антитело с раствором антитела1 в соотношении 1:1000 и добавьте 10 мл первичного антитела в новую инкубационную коробку. Поместите инкубационный бокс в холодное помещение с температурой 4 °C и поставьте его на шейкер на ночь.
  6. Инкубация вторичных антител
    1. На следующий день соберите первичное антитело в инкубационную коробку, затем добавьте соответствующий раствор TBST и поместите его на шейкер для промывки на 5 минут, повторите 3 раза.
    2. Приготовьте вторичное антитело с 5% раствором молока в соотношении 1:5000. Капните 1 мл вторичного антитела на дно увлажненной гибридизационной коробки. Поместите мембрану PVDF белковой стороной вниз на вторичное антитело, а затем инкубируйте в RT на низкоскоростном шейкере в течение 1,5 ч.
    3. Добавьте подходящий раствор TBST и поместите его в шейкер для мытья на 5 минут; Повторите 3 раза.
  7. Обнажение полосок
    1. Возьмите равные объемы хемилюминесцентных реактивов А и В, встряхните, хорошо перемешайте. Защитите раствор от света.
    2. Равномерно нанесите проявляющий раствор на мембрану из ПВДФ, осторожно встряхивая ее, чтобы убедиться, что мембрана равномерно покрыта раствором.
    3. Поместите мембрану в систему визуализации геля и установите время воздействия, количество контактов и другие соответствующие параметры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проявитель должен полностью покрыть полосу, а разработка должна находиться в темной среде.

Результаты

Чтобы отсеять малые молекулы Salvia miltiorrhiza Bge, которые могут эффективно ингибировать UCHL3, мы выполнили молекулярный докинг между малыми молекулами, полученными с веб-сайта TCMSP, с UCHL3. Первые 30 малых молекул в результатах докинга и их баллы приведены в таблице 1

Обсуждение

DUB играют решающую роль в регуляции гомеостаза всей убиквитиновой системы, удаляя убиквитин из субстратов или полиубиквитиновых цепей. В последние годы эти ферменты также привлекли большое внимание в качестве мишенейдля разработки лекарств

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Пекина [грант No 7244498].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

Ссылки

  1. Ciechanover, A. The ubiquitin proteolytic system and pathogenesis of human diseases: A novel platform for mechanism-based drug targeting. Biochem Soc Trans. 31 (2), 474-481 (2003).
  2. Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by e1 enzymes: The apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 319-331 (2009).
  3. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (11), 755-764 (2009).
  4. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (10), 626-642 (2016).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: Structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Clague, M. J., et al. Deubiquitylases from genes to organism. Physiol Rev. 93 (3), 1289-1315 (2013).
  7. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: Deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (6), 338-352 (2019).
  8. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: Emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 17 (1), 57-78 (2018).
  9. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of deubiquitinase specificity and regulation. Annu Rev Biochem. 86, 159-192 (2017).
  10. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L., Rose, I. A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (4), 1783-1786 (1980).
  11. Abdul Rehman, S. A., et al. Mindy-1 is a member of an evolutionarily conserved and structurally distinct new family of deubiquitinating enzymes. Mol Cell. 63 (1), 146-155 (2016).
  12. Storer, A. C., Ménard, R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500 (1994).
  13. Lange, S. M., Armstrong, L. A., Kulathu, Y. Deubiquitinases: From mechanisms to their inhibition by small molecules. Mol Cell. 82 (1), 15-29 (2022).
  14. Ndubaku, C., Tsui, V. Inhibiting the deubiquitinating enzymes (dubs). J Med Chem. 58 (4), 1581-1595 (2015).
  15. Schauer, N. J., Magin, R. S., Liu, X., Doherty, L. M., Buhrlage, S. J. Advances in discovering deubiquitinating enzyme (dub) inhibitors. J Med Chem. 63 (6), 2731-2750 (2020).
  16. Magin, R. S., et al. Small molecules as tools for functional assessment of deubiquitinating enzyme function. Cell Chem Biol. 28 (7), 1090-1100 (2021).
  17. Dang, L. C., Melandri, F. D., Stein, R. L. Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin c-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37 (7), 1868-1879 (1998).
  18. Li, Y. T., et al. New semi-synthesis of ubiquitin c-terminal conjugate with 7-amino-4-methylcoumarin. J Pept Sci. 20 (2), 102-107 (2014).
  19. Feng, X., et al. Ubiquitination of UVRAG by SMURF1 promotes autophagosome maturation and inhibits hepatocellular carcinoma growth. Autophagy. 15 (7), 1130-1149 (2019).
  20. Qin, X., et al. Identification of an autoinhibitory, mitophagy-inducing peptide derived from the transmembrane domain of USP30. Autophagy. 18 (9), 2178-2197 (2022).
  21. Borodovsky, A., et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  22. Ovaa, H. Active-site directed probes to report enzymatic action in the ubiquitin proteasome system. Nat Rev Cancer. 7 (8), 613-620 (2007).
  23. Ekkebus, R., Flierman, D., Geurink, P. P., Ovaa, H. Catching a dub in the act: Novel ubiquitin-based active site-directed probes. Curr Opin Chem Biol. 23, 63-70 (2014).
  24. D'arcy, P., et al. Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy. Nat Med. 17 (12), 1636-1640 (2011).
  25. Sucher, N. J. The application of Chinese medicine to novel drug discovery. Expert Opin DrugDiscov. 8 (1), 21-34 (2013).
  26. Jung, I., Kim, H., Moon, S., Lee, H., Kim, B. Overview of salvia miltiorrhiza as a potential therapeutic agent for various diseases: An update on efficacy and mechanisms of action. Antioxidants (Basel). 9 (9), 857 (2020).
  27. Wang, Z., Peters, R. J. Tanshinones: Leading the way into lamiaceae labdane-related diterpenoid biosynthesis. Curr Opin Plant Biol. 66, 102189 (2022).
  28. Bai, M., et al. Astrocytes and microglia-targeted danshensu liposomes enhance the therapeutic effects on cerebral ischemia-reperfusion injury. J Control Release. 364, 473-489 (2023).
  29. Zhang, H., et al. Salvianolic acid a protects RPE cells against oxidative stress through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Free Radic Biol Med. 69, 219-228 (2014).
  30. Wang, R., et al. Danshensu inhibits sars-cov-2 by targeting its main protease as a specific covalent inhibitor and discovery of bifunctional compounds eliciting antiviral and anti-inflammatory activity. Int J Biol Macromol. 257 (Pt 2), 128623 (2024).
  31. Misaghi, S., et al. Structure of the ubiquitin hydrolase UCH-L3 complexed with a suicide substrate. J Biol Chem. 280 (2), 1512-1520 (2005).
  32. Wing, S. S. Deubiquitinating enzymes--the importance of driving in reverse along the ubiquitin-proteasome pathway. Int J Biochem Cell Biol. 35 (5), 590-605 (2003).
  33. Samy, M. A., Abd El Fatah, N. M., Yahia, S. E., Arafa, R. K. Friend or foe: UCHL3 mediated carcinogenesis and current approaches in small molecule inhibitors' development. Curr Med Chem. 28 (42), 8782-8799 (2021).
  34. Hafez, N., Modather El-Awadly, Z., Arafa, R. K. UCH-L3 structure and function: Insights about a promising drug target. Eur J Med Chem. 227, 113970 (2022).
  35. Song, Z., et al. A novel UCHL(3) inhibitor, perifosine, enhances PARP inhibitor cytotoxicity through inhibition of homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Cell Death Dis. 10 (3), 398 (2019).
  36. Hirayama, K., Aoki, S., Nishikawa, K., Matsumoto, T., Wada, K. Identification of novel chemical inhibitors for ubiquitin c-terminal hydrolase-L3 by virtual screening. Bioorg Med Chem. 15 (21), 6810-6818 (2007).
  37. Nijman, S. M., et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell. 123 (5), 773-786 (2005).
  38. Guo, M., et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 12 (4), 1723-1739 (2022).
  39. Chavanieu, A., Pugnière, M. Developments in spr fragment screening. Expert Opin Drug Discov. 11 (5), 489-499 (2016).
  40. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  41. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  42. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
  43. Fan, Z., Wang, S., Xu, C., Yang, J., Cui, B. Mechanisms of action of fu fang gang liu liquid in treating condyloma acuminatum by network pharmacology and experimental validation. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 128 (2023).
  44. Tirat, A., et al. Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2. Anal Biochem. 343 (2), 244-255 (2005).
  45. Hassiepen, U., et al. A sensitive fluorescence intensity assay for deubiquitinating proteases using ubiquitin-rhodamine110-glycine as substrate. Anal Biochem. 371 (2), 201-207 (2007).
  46. Chan, W. C., et al. Accelerating inhibitor discovery for deubiquitinating enzymes. Nat Commun. 14 (1), 686 (2023).
  47. Haj-Yahya, N., et al. Dehydroalanine-based diubiquitin activity probes. Org Lett. 16 (2), 540-543 (2014).
  48. Li, G., Liang, Q., Gong, P., Tencer, A. H., Zhuang, Z. Activity-based diubiquitin probes for elucidating the linkage specificity of deubiquitinating enzymes. Chem Commun (Camb). 50 (2), 216-218 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213Danshensuin vitroUB AMCHA UB VS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены