Разработка системы протопластов капусты для изучения толерантности к гипоксии у капусты

Резюме

Этот протокол описывает эффективную систему протопластов мезофилла капусты. Были протестированы различные методы лечения с недостатком кислорода, и система показала высокую активацию генов, реагирующих на гипоксию, что способствовало изучению генетических и молекулярных механизмов толерантности к затоплению у овощей сорта Brassicaceae .

Аннотация

Поскольку изменение климата приводит к увеличению количества обильных дождей, капуста, ключевой овощ семейства Brassicaceae , сталкивается со значительными потерями урожая из-за стресса, вызванного наводнениями. Для выявления механизмов толерантности к затоплению у кочанов необходима универсальная платформа для генетических функциональных исследований, позволяющих преодолеть трансформационно-неподатливый характер кочанов. В данном исследовании была разработана система экспрессии переходных процессов капустных протопластов и соответствующий протокол индукции гипоксии протопластов. Этот протокол позволил добиться высокой урожайности и целостности выделения протопластов из капустных листьев, при этом эффективность трансфекции превысила 40% при использовании оптимизированных ферментативных условий. Чтобы смягчить потенциальное гипоксическое воздействие перед лечением, раствор W5 пузырчат с газообразным кислородом для повышения уровня растворенного кислорода. Было протестировано несколько химических веществ для регулировки уровня кислорода и физиологического поглощения кислорода, включая EC-Oxyraze, OxyFluor, сульфит натрия и упаковку для поглощения кислорода. Анализ на двойную люциферазу показал, что промоторы генов анаэробной реакции дыхания BoADH1 и BoSUS1L активировались в протопластах капусты после лечения гипоксией, при этом самый высокий уровень индукции наблюдался после лечения пакетом поглотителей кислорода. Таким образом, система экспрессии протопластов капусты в сочетании с лечением гипоксии демонстрирует эффективную и удобную платформу. Эта платформа может облегчить изучение функции генов и молекулярных механизмов, связанных с реакцией на гипоксию у капусты.

Введение

Глобальное изменение климата усугубило проблему наводнений, которая становится все более критической проблемой во всем мире. В последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению частоты наводнений, что приводит к значительным потерям урожая ^1,2. Капуста (Brassica oleracea var. capitata L.), овощ значительного мирового значения, подвержена неблагоприятному воздействию обильных дождей, что обуславливает необходимость разработки устойчивых к наводнениям сортов капусты для обеспечения устойчивого производства в условиях экстремальных погодных явлений. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, связанных со стрессом затопления в капусте, имеет важное значение для решения этой проблемы.

Чтобы понять механизмы регуляции генов у растений в подводных условиях, трансгенные линии широко используются для генетических функциональных исследований. Однако этот подход ограничен высокими затратами, трудоемкими процессами трансформации и субкультур, а также низкой эффективностью трансформации у многих видов сельскохозяйственных культур, что требует разработки альтернативных методологий. Транзиентные экспрессионные системы на основе протопластов широко применяются в молекулярных исследованиях растений в качестве универсальной и эффективной альтернативы. Эти системы облегчают исследования промоторной активности, сигнальных путей в ответ на сигналы окружающей среды, взаимодействий белок-белок или белок-ДНК, а также субклеточной^{локализации.} Сообщалось о создании протопластовых переходных систем экспрессии не только на модельных ^{растениях 4,5}, но и на экономически важных культурах, таких как сахарный тростник⁶, гвоздика⁷, орхидеи фаленопсис ⁸ и баклажаны⁹. Кроме того, эти системы были успешно внедрены на древесных растениях, включая Camellia oleifera¹⁰и Populus trichocarpa¹¹. Тем не менее, протоколы применения протопластных систем для изучения листовых овощей в условиях гипоксического стресса, вызванного погружением, ограничены. Поэтому в данной работе был разработан интегрированный протокол для тех, кто заинтересован в изучении реакций гипоксии у листовых овощей с использованием системы экспрессии переходных процессов капустных протопластов.

Для осуществления реакции гипоксии, вызванной погружением, на клеточном уровне, в предыдущих исследованиях было использовано несколько методологий поглощения кислорода для моделирования гипоксических сред. К ним относятся использование EC-Oxyraze, OxyFluor, сульфита натрия и пакетов, потребляющих кислород. EC-оксиразу обычно используется для анаэробного лечения клеточных линий^{человека 12} и протопластов Arabidopsis ¹³. Было обнаружено, что оксифтор эффективен в смягчении фотообесцвечивания, вызванного активными формами кислорода во время флуоресцентной визуализации живых клеток^14,15. Сульфит натрия используется в анаэробной обработке нематод¹⁶ и, в последнее время, в протопластах риса в сочетании с такими методами, как иммунопреципитация хроматина (ChIP)¹⁷. Пакеты поглотителей кислорода, используемые в основном для анаэробного бактериального культивирования¹⁸, также продемонстрировали эффективность в индуцировании активации промоторов ZmPORB1 в протопластах кукурузы в анаэробных условиях¹⁹.

Настоящая работа направлена на создание надежного конвейера для выделения протопластов капусты и экспрессии переходных процессов. Впоследствии эффективность различных методов лечения, корректирующих кислород, оценивалась путем оценки промоторной активности генов анаэробного ответа с использованием анализов на двойную люциферазу. Ожидается, что протокол, разработанный в этом исследовании, будет ценным для будущих исследований, связанных с погружением или гипоксическим стрессом в системах Brassica .

протокол

В исследовании использовались два сорта товарной капусты (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' и '228'. Графическое представление рабочего процесса протокола показано на рисунке 1. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка рассады капусты

1. Сеять семена капусты 'Фуюдори' и '228' с использованием коммерческого растительного субстрата в круглые квадратные отверстия (Г 4,5 см x В 4,5 см) 48-луночных противней (Д 49 см x Ш 28 см x В 5 см). Заделайте семена примерно на 1 см вглубь питательной среды.
2. Выращивайте рассаду капусты в комнате для выращивания при температуре 22 °C с циклом свет-темнота 16/8 ч. Поддерживайте интенсивность света 100 μмоль ^м-2·^с-1 (белая люминесцентная трубка) во время световой фазы.
3. Через 2-3 недели роста используйте рассаду капусты на стадии 2-х листьев для дальнейшего выделения мезофилла протопластов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый размер рассады капусты – это стадия с 2 листьями, при которой второй настоящий лист полностью раскрыт, но третий настоящий лист не развернут, а его длина короче 1 см (рисунок 2А). Чтобы синхронизировать стадии развития рассады капусты, семена сорта 'Фуюдори' необходимо высевать примерно на 2 дня раньше, чем семена сорта '228' из-за их разной скорости роста. Такая корректировка обеспечивает равномерный рост и созревание среди растений капусты на желаемой стадии.

2. Выделение протопластов капусты

1. Перед каждым выделением протопластов приготовьте 12,5 мл раствора фермента (табл. 1).
   1. Предварительно нагрейте раствор с 10 мМ MES (pH 5,7) и 0,6 М маннитола до 55 °C. Продолжайте нагревать раствор при температуре 55 °C в течение 10 минут после добавления 1,5% целлюлазы R10 и 0,75% мацероцима R10.
   2. После того как раствор фермента остынет до комнатной температуры (25 °C), добавьте 10 мМ CaCl₂ и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Фильтр стерилизуют приготовленный ферментный раствор в чашку Петри диаметром 9 см с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный подогрев раствора повышает растворимость ферментов и инактивирует протеазу. Эффекты пищеварения варьируются в зависимости от различных типов ферментов целлюлазы. Комбинация целлюлазы R10 и мацероцима R10 подходит для выделения протопластов капусты.
2. Соберите вторые только что раскрывшиеся настоящие листья от пяти до восьми рассадных капуст, и нарежьте их полосками по 0,5-1,0 мм с помощью острого лезвия бритвы. Сразу же переложите полоски листьев в свежеприготовленный ферментный раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор здоровых и выделенных листьев из капусты на правильном этапе имеет решающее значение. Вторые вновь расширенные истинные листья из рассады капусты на стадии 2 листьев обеспечивают наибольшую эффективность изоляции протопластов. Перезрелые растения, семядоли или состаренные листья не рекомендуется для выделения протопластов. Из пяти-двенадцати хорошо разросшихся настоящих листьев можно успешно дать капустные протопласты в 12,5 мл ферментного раствора. Количество листьев, необходимых для выделения протопластов, зависит от желаемого необходимого количества протопластов. Как правило, протопластов, полученных от пяти до восьми листьев, достаточно для последующих экспериментальных процедур.
3. После вакуумной инфильтрации в темноте в течение 30 минут (рисунок 2B) подержите полоски капустных листьев погруженными в раствор фермента (рисунок 2C) в темноте при комнатной температуре еще 4-16 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время переваривания ферментов может варьироваться в зависимости от сорта капусты и должно быть оптимизировано в соответствии с конкретным генотипом. Например, сорт 'Fuyudori' требует более длительного времени переваривания (16 часов) по сравнению с сортом '228' (4 часа) из-за более толстых листьев сорта 'Fuyudori'.
4. Разбавьте раствор, содержащий протопласты, равным объемом раствора W5, который состоит из 2 мМ MES (pH 5,7), 154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl и 5 мМ глюкозы (см. Таблицу 1 для приготовления), чтобы остановить ферментативное расщепление.
5. Освободите суспензию протопласта путем легкого вращения или с помощью орбитального встряхивателя. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
   Выделенные протопласты способны проходить через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, в то время как неперепреданные растительные остатки задерживаются в сетчатом фильтре и впоследствии удаляются из суспензии. Сетчатые фильтры можно использовать повторно и хранить в 75% этаноле после стирки, но перед использованием необходимо полностью промыть сетчатые фильтры раствором W5 для удаления остатков этанола.
6. Центрифугируйте раствор протопластов со 150 x g в течение 2 мин при 4 °C, затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Осторожно промойте гранулированные протопласты, добавив 10 мл раствора W5 вдоль стенки конической трубки с приблизительной скоростью потока 1 мл·^с-1. Центрифугируйте пробирку при 150 x g в течение 2 минут при 4 °C и повторите эту процедуру промывки еще раз, чтобы обеспечить полное удаление ферментного раствора.
7. Ресуспендируйте протопласты в растворе W5 и поместите их на лед на 30 минут. После инкубации льда удаляйте надосадочную жидкость пипеткой по 1 мл за один раз до тех пор, пока не будет удалена вся надосадочная жидкость.
8. Ресуспендируйте протопласты в предварительно охлажденном льдом растворе MMG, состоящем из 4 мМ MES (pH 5,7), 0,4 M маннитола и 15 мМ MgCl₂ (приготовление см. в Таблице 1 ).
9. Измерьте концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра и отрегулируйте конечную концентрацию до 4 x 10⁵ протопластов·^мл-1 с помощью раствора MMG.

3. Трансфекция протопластов

1. Смешайте общий объем 10 мкл плазмиды (5-10 мкг) (Дополнительный файл 1) со 100 мкл протопластов (4 x 10⁴ протопласта) и положите на лед на 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки плазмид трансфекционного класса используется коммерчески доступный набор плазмид в соответствии с инструкциями производителя. Приблизительно 4 x 10⁴ протопласта обычно используются в двойном люциферазном репортерном анализе. Для более масштабных экспериментов доступно большее количество протопластов для трансфекции. В частности, около 2 x 10⁵ протопластов, трансфицированных 10 мкг плазмиды, демонстрируют доказанную эффективность трансфекции в диапазоне от 30% до 40%.
2. Добавьте равный объем (110 мкл) свежеприготовленного раствора ПЭГ (см. Таблицу 1 для приготовления), содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000 (PEG4000), 0,1 М CaCl₂ и 0,2 М маннита, и осторожно перемешайте.
3. Инкубируйте смесь протопластов при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут, затем добавьте 440 μL раствора W5 для завершения реакции.
4. Центрифугируйте трансфицированные протопласты при 150 x g в течение 2 мин при 4 °C и ресуспендируйте гранулу в 750 мкл обогащенного кислородом раствора W5. Перенесите ресуспендированные протопласты на 6-луночный планшет для культуры тканей, предварительно покрытый 1% BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор W5, используемый для инкубации клеток, должен быть пузырчатым с кислородом с помощью кислородного концентратора (~90% кислорода), подключенного к воздушному камню, в течение 5 минут (Рисунок 2D). После этого процесса оксигенации конечная концентрация растворенного кислорода в растворе W5 увеличилась с 7,84 мг· ^L-1 ± 0,05 мг· ^L-1 до 29,18 мг· ^L-1 ± 0,43 мг· ^L-1, измеренный с помощью измерителя растворенного кислорода. Объем раствора W5 для ресуспендирования трансфицированных протопластов зависит от типа используемой тарелки для культуры клеток ткани. Для 12-луночных или 24-луночных планшетов для культивирования клеток рекомендуется уменьшить объем раствора W5, чтобы смягчить стресс гипоксии во время инкубации из-за большей глубины внутри лунок. Для нанесения покрытия БСА на каждую лунку культуральной пластины получали 1 мл 1% раствора БСА, которому давали покрыть лунки в течение 10 с. Затем раствор BSA сбрасывали из каждой скважины, а затем заполняли скважины раствором W5. Эта процедура была направлена на создание временной неадгезивной поверхности с помощью BSA, эффективно предотвращающей прилипание протопластов к пластиковой поверхности культуральной пластины во время последующих экспериментальных этапов.

4. Лечение гипоксии на капустных протопластах

1. Проводите химическую или физически индуцированную терапию гипоксии сразу после трансфекции протопластов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется применять лечение гипоксии сразу после трансфекции протопластов. Длительная инкубация протопластов может уменьшить последующую реакцию гипоксии.
   1. Для химически индуцированной гипоксии на протопластах капусты добавьте OxyFluor, EC-Oxyrase и сульфит натрия в раствор протопластов W5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 0,6 ЕДк·^мл-1 EC-оксиразы, 0,6 ЕД·^мл-1 OxyFluor и 1 г·^мл-1 сульфита натрия в W5 были протестированы условия, способные индуцировать промоторы BoADH1 и BoSUS1L (Рисунок 3A) с низким повреждением целостности протопластов в двух рассмотренных сортах капусты.
   2. При гипоксии, вызванной потреблением кислорода, поместите два пакета поглотителей кислорода в анаэробную банку объемом 3,5 л, чтобы создать гипоксическую среду.
2. Соберите обработанные гипоксией протопласты путем центрифугирования при 150 x g в течение 2 мин при 4 °C. Собранные протопласты заморозьте с помощью жидкого азота и храните их в морозильной камере при температуре -80 °C для последующих анализов.

5. Двойной анализ люциферазы

1. Провести репортерный анализ на двойную люциферазу в соответствии с инструкциями производителя с незначительными изменениями.
   1. Ресуспендируйте протопласты капусты в 50 мкл 1x пассивного лизисного буфера и вихря в течение 10 с.
   2. Инкубируйте разрушенные протопласты на льду в течение 10 минут и собирайте надосадочную жидкость после центрифугирования при 10 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   3. Добавьте по 20 мкл клеточного лизата в каждую лунку микропланшета. Внесите 100 мкл реагента II для анализа люциферазы в лунки и измерьте активность люциферазы светлячков с помощью считывателя микропланшетов.
   4. Добавьте 100 мкл коммерчески доступного реагента для анализа в каждую лунку и измерьте активность люциферазы Рениллы с помощью считывателя микропланшетов.

Результаты

В этой работе была успешно разработана система переходной экспрессии с использованием протопластов капусты (см. Рисунок 1 для рабочего процесса). Протопласты выделяли из 2-3-недельных настоящих листьев капусты соответствующего размера (рис....

Обсуждение

Этот протокол представляет собой оптимизированный метод выделения протопластов из двух коммерческих сортов капусты. Эффективность этого метода в первую очередь оценивается по двум важнейшим параметрам контроля качества: выходу жизнеспособных протопластов и эффек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation