Неинвазивная 3D-визуализации с суб-микронных Резолюция Использование синхротронного рентгеновского томографии

Резюме

Мы использовали синхротронное рентгеновской томографии в радиационной европейских синхротронного Facility (ESRF) для неинвазивного производить 3D-томографических данных с пиксель-разрешением 0.7μm. Используя программное обеспечение объема рендеринг, это позволяет реконструкция внутренних структур в их естественном состоянии без артефактов производства гистологических срезов.

Аннотация

Мало что известно о внутренней организации многих микро-членистоногих с телом размером менее 1 мм. Причины, которые являются малые размеры и жесткие кутикулы, что затрудняет использование протоколов классической гистологии. Кроме того, гистологических срезов разрушает образец и поэтому не могут быть использованы для уникального материала. Таким образом, неразрушающий метод является желательным, который позволяет просматривать внутри небольших образцов без необходимости секционирования.

Мы использовали синхротронное рентгеновской томографии в радиационной европейских синхротронного Facility (ESRF) в Гренобле (Франция) для неинвазивного производить 3D-томографических данных с пиксель-разрешением 0.7μm. Используя программное обеспечение объема рендеринг, это позволяет нам реконструировать внутреннюю организацию в своем естественном состоянии, без артефактов производства гистологических срезов. Эти даты могут быть использованы для количественной морфологии, достопримечательностях, или для визуализации анимационных фильмов, чтобы понять структуру скрытые части тела и следовать за полные системы органов или тканей путем проб.

протокол

Животных, используемых в данном исследовании

Образцы партеногенетических панцирных клещей Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) взяты из нашей лаборатории культуры. Культура растет на гипс / уголь смесь (9:1) в пластиковые банки, в постоянной темноте при 20-23 ° С около 90% влажности воздуха.

Пробоподготовка

1. Образцы были взяты из культуры, чистить мягкой щеткой и помещен в 6:03:01 смесь 80% этанола, 35% формальдегида и 100%-ной уксусной кислотой в течение 24 часов.
2. После этого образцы были обезвожены в серии градуированных этанола на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% с 3 изменений при каждой концентрации, и в 10 минутах между ступенями.
3. Наконец, образцы помещались в пресной 100% этилового спирта в ночное время и критическая точка сушат в CO ₂ (CPD 020, Balzers). Высушенные образцы были прикреплены к кончику пластмассовых штифта (1,2 см длиной, 3,0 мм в диаметре).

Синхротронное рентгеновской томографии

Рентгеновской томографии была выполнена в beamline ID19 (ESRF, Гренобль, Франция, эксперимент SC-2127).

1. Образцы были установлены в стаканчик и доводили до центрального положения в пучке.
2. Образцы были измерены с энергией 20,5 кэВ. Рентгенограммы были записаны с охлаждением ПЗС (ESRF Фрелон камеры) с 14-битным динамическим диапазоном, 2048 × 2048 пикселей и эффективный размер пикселя 0,7 мкм. 1500 прогнозы были зарегистрированы более 180 вращения образца ° с временем экспозиции 0,35 с для каждой проекции. Детектора к образцу расстояние 20 мм.

Использование определенного расстояния между образцом и детектором позволяет дифференциальных визуализации материалов с низкой рентгеновской коэффициентов затухания (Cloetens и соавт. 1996), который будет производить недостаточная контрастность изображения в поглощении (где образец расположен непосредственно перед детектором ). Большинство биологических вопросы фазовых объектов, состоящий из материалов с низким поглощения и / или только небольшие различия в атомный номер (Бец, и соавт. 2007). Однако, фаза расширенной томографии требует высокой пространственной когерентности однородного пучка рентгеновских лучей. Таким образом, синхротронное излучение лучше подходит, чем настольных сканеров для такого рода измерений.

Анализ данных

1. В результате 2D рентгенограммы были преобразованы в 3D воксела данных (8-бит серого значений) с фильтром резервного проекции алгоритм (Cloetens и соавт., 1997)
2. Воксела данные были проанализированы с помощью программного обеспечения VGStudio Макс 1.2.1. (Том Графика, Гейдельберг, Германия).
3. Серый значения от фона были удалены из гистограммы для 3D-визуализации.
4. Предустановленные камеры пути были использованы для создания вращательного анимации и анимационных плоскостей отсечения.
5. Определяемые пользователем пути камеры была создана следовать пищеварительной системы А. longisetosus.

Обсуждение

В этой презентации, мы сосредоточились на 3D-визуализации внутренней анатомии chelicerate микро-членистоногих. Синхротронного рентгеновского измерения позволяют пикселей разрешением до 0.3 мкм, в зависимости от размера выборки. Здесь мы показали данные с 0.7μm пикселей разрешение. Как правило, синхротро?...