Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

Резюме

В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эволюционно консервативных механизмов для модуляции нейронной синхронии и имеет значение для лечения эпилепсии и эпилептические припадки.

Аннотация

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.

Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.

Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

протокол

Альдикарб выдержки Paradigm

1. В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждой репликации будут доступны для альдикарб пробы на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
   
   
2. На второй день, сделайте 100 мМ исходный раствор альдикарб с 70% этанола (этанол) и 30% DDH ₂ O. Распространение соответствующее количество альдикарб на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации альдикарб. Мы последовательно использовать 0,5 мМ альдикарб при посеве 37,5 мкл 100 мМ альдикарб на 7,5 мл NGM пластин. Разрешить альдикарб пластин высохнуть в течение примерно 30-60 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, альдикарб могут быть добавлены к НГО и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
    
3. После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50) на центре каждой пластины альдикарб и сухой в течение еще ​​30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
    
4. Когда пища газона сухая, можно приступить альдикарб анализов. Из-за субъективного характера анализы алдикарб, настоятельно рекомендуется, что эксперименты проводить "вслепую". Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин альдикарб непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также устойчивый штамм и сверхчувствительным напряжения, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее шести штаммов одновременно.
    
5. Подсчитайте количество парализована червей подталкивая в согласованном порядке каждого червя с платиновой проволоки. Мы последовательно подтолкнуть наших червей в два раза по голове и два раза на хвост каждые 30 минут в общей сложности три часа. Прекращение глотки насосные также может быть использован для определения паралич, но только если экспериментатор использует последовательное определение паралич на все анализы. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, которые устойчивы к алдикарб, может попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота, физический барьер для передвижения червей, около альдикарб пластин. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.

PTZ выдержки Paradigm

1. В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждого повторить будет доступен для тестов PTZ на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
   
   
2. На второй день, сделайте 0,5 г PTZ / мл DDH ₂ O исходного раствора PTZ. Распространение соответствующее количество PTZ на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации PTZ. Потому что мы предпочитаем доза-реакция анализы для PTZ, мы пластины различного количества PTZ на 7,5 мл NGM пластин. Например, можно пластины 37,5 мкл исходного раствора PTZ на 7,5 пластины NGM мл, чтобы сделать 5 мг PTZ / мл раствора. Разрешить PTZ пластин высохнуть в течение примерно 60-120 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, PTZ могут быть добавлены непосредственно в НГО, но она должна быть немедленно использованы для анализов после затвердевания. Стабильность PTZ значительно меньше, чем у альдикарб. Таким образом, тесты со взрослыми пластин PTZ являются менее надежными. PTZ следует хранить при температуре -20 ° С в сушильном шкафу с сушильного агента перед использованием. Мы предпочитаем отказаться от PTZ примерно через два месяца после открытия, чтобы обеспечить стабильность.
   
   
3. После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50)на центре каждой пластины PTZ и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
    
4. Когда пища газона сухая, можно продолжить анализы PTZ. Хотя PTZ анализы менее субъективным, чем анализы алдикарб, он по-прежнему настоятельно рекомендуется проводить эксперименты «вслепую». Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин PTZ непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также штаммов с передним или полным тело конвульсии, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее трех штаммов одновременно. Тем не менее, частота и интенсивность PTZ-индуцированные судороги обычно пик 15-30 минут воздействия, а затем затухают, как черви стали парализованными или, в некоторых случаях, акклиматизироваться к препарату.
   
   
5. Посчитайте количество "эпилептического типа" конвульсиях червей каждые 30 минут в общей сложности один час. Лучше всего, чтобы оценка количества червей с передней судороги, которые мы называем "голова качается", отдельно от количества червей с полным тело конвульсии, полный паралич тела, которую мы называем "тоник", или сочетание передняя судороги с BWM паралич, который мы называем "тонико-клонические". Большинство червей одного генотипа проявляют лишь один вид судорог. Тем не менее, тонико-клонические черви зачастую становятся полностью тоник, поэтому следует продолжать анализ последних 30 минут, даже если все черви уже выставлены судороги. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви могут попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота вокруг пластин PTZ. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.

Поведенческие реакции Выбранный C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи в альдикарб и PTZ

Мутант Имя	Роль Synaptic	Поведение без наркотиков	Поведенческий ответ на альдикарб (по сравнению с диким типом N2)	Поведенческий ответ на PTZ
Том-1 (ok188)	тормозит синаптическую передачу	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	неотличимы от дикого типа
UNC-43 (n498n1186)	комплекс	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	все тело конвульсии
UNC-25 (e156)	ГАМК способствует передаче	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	передняя судороги, все тело паралич
СНБ-1 (md247)	способствует синаптической передачи	несогласованный	сниженной ставке паралич	передняя судороги
UNC-4 (E120)	способствует передаче АЧ	несогласованный	сниженной ставке паралич	неотличимы от дикого типа

Два нейронных стимуляторов, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарб, и антагонист рецепторов ГАМК, называемый pentylenetetrazole (PTZ), могут быть использованы на основе взаимодополняемости, чтобы охарактеризовать C. Элеганс синаптической передачи мутантов. Превышение возбуждающие ацетилхолина (АХ) накапливается в теле червя стену нервно-мышечного соединения (NMJs) от вредных мутаций в негативных регуляторов АЧ передачи (например, том-1 и UNC-43) или положительный регуляторы тормозных ГАМК-передачи (например, UNC-25). С другой стороны, возбуждающие уровни ацетилхолина на червя NMJs уменьшаются на вредных мутаций в положительной регуляторы общей синаптической передачи (например, SNB-1) или АЧ-специфических генов передачи (например, UNC-4). По сравнению с диким типом червей N2, червей мутантов с повышенной передачи возбуждающих АЧ на NMJs обладают повышенной скорости альдикарб вызванного параличом, в то время как черви мутанта с пониженной передаче возбуждающих АЧ демонстрируют снижение темпов альдикарб вызванного параличом. Хотя PTZ нарушает нейронные синхронность в Элеганс C. мышцах стенки тела, а не в отличие от алдикарб, PTZ также противодействует тормозных ГАМК в мышцах C. Элеганс голову. В результате, альдикарб чувствительность не может точно предсказать PTZ чувствительности. Мутант червей с конкретными дефектами в отрицательной или положительной RegulЭйшен передачи АЧ неотличимы от дикого типа N2 червей в присутствии PTZ, в то время как мутант червей с дефектами в положительной регуляции общего синаптической передачи или конкретных дефектов в тормозной ГАМК выставку передачи надежной PTZ-индуцированной передней судороги. Более того, UNC-43 с потерей функции мутантов отображения всего тела судороги в присутствии PTZ и, вероятно, имеют дополнительные нарушения синаптической передачи, которые способствуют их уникальных ответов препарата.

Обсуждение

Действующие протоколы по альдикарб экспозиции с C. Элеганс не позволяют экспериментаторам различать мутанты с конкретными дефицита ацетилхолина передачи и мутанты с обобщенными дефицит в синаптической передаче, так как оба класса мутантов выставку сопротивление альдикарб. Кроме того, алди...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aldicarb	Reagent	Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma-Aldrich	P6500