Для начала посейте клетки остеосаркомы человека 143B в шестилуночную пластину. Как только клетки станут на 75% сливающимися, замените среду в каждой лунке средой, содержащей 10 миллимоляров аспартата 13C4, и инкубируйте в течение восьми часов, чтобы достичь устойчивого состояния для маркировки клеток. Для выделения метаболитов охладите приготовленный буфер на ночь при температуре минус 80 градусов Цельсия или поместите его на сухой лед.
Тем временем возьмите тарелку из инкубатора и аспирируйте среду из каждой лунки с помощью пипетки. Дважды промойте его PBS, а затем удалите остатки PBS, прежде чем продолжить. Теперь поставьте тарелку на сухой лед и добавьте в каждую лунку по 800 микролитров подготовленного буфера.
Чтобы облегчить лизис клеток, инкубируйте пластину в течение 15 минут при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После инкубации соскребите каждую лунку на сухом льду с помощью подъемника клеток и перенесите лизат в 15-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, помещенную на сухой лед. Встряхните лизат в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте его при четырех градусах Цельсия и 17 000 г в течение 10 минут.
Затем перенесите надосадочную жидкость в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и высушите ее в вакуумном концентраторе с температурой четыре градуса Цельсия с холодной ловушкой в высоком вакууме в течение примерно шести часов. Храните высушенные гранулы метаболита при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Для анализа образца с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или LCMS, добавьте 100 микролитров воды класса ВЭЖХ в высушенную гранулу и вихрь, как показано на рисунке.
Центрифугируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут на максимальной скорости. Затем перенесите 25 микролитров надосадочной жидкости во флакон LCMS и введите два микролитра в систему LCMS. Для выполнения жидкостной хроматографии используйте постоянную скорость потока 0,15 миллилитра в минуту в режиме градиента подвижной фазы B от 80 до 20% в течение 20 минут, от 20 до 80% в течение 0,5 минут и удерживайте на уровне 80% в течение 7,5 минут против подвижной фазы A. Затем выполните масс-спектроскопию, выбрав полное сканирование от mz 70 до 1, 000 000 дальтонов.
И разрешение на уровне 70 000. Установите цель AGC от 10 до шестой секунды и максимальное время впрыска 20 миллисекунд. Затем установите время выполнения на 16,5 минут.
Полярность установлена на положительную. Целевой показатель СМЖЛ установлен на уровне один в степени пяти. Максимальное значение ИТ установлено на 20 миллисекунд.
А диапазон сканирования установлен на 70 к 1 000 масс/заряд. Затем установите напряжение распыления на 3,0 киловольта. И нагретый капилляр при 275 градусах по Цельсию.
Выберите расход газа в оболочке на 40 единицах, расход вспомогательного газа на 15 единицах и расход газа на одном блоке. Для отслеживания изотопа глутамина 13C5, как только клетки достигнут слияния 75%, измените среду на двухмиллимолярную среду 13C5, содержащую глутамин, и инкубируйте для достижения устойчивого состояния маркировки интересующих клеток. Изолируйте и проанализируйте метаболиты, как было показано ранее.
После выделения и анализа метаболитов проанализируйте активность сукцинатдегидрогеназы или SDH, рассчитав процентное пометку фумарата 13C3, фумарата 13C4, сукцината 13C3 и сукцината 13C4. Затем оцените окисление сукцината и восстановление фумарата по формуле. В условиях, обработанных транспортным средством, комплекс SDH способствовал прямой активности, и включение сукцината 13C4 в фумарат 13C4 было выше, чем фумарат 13C3 в сукцинат 13C3.
В клетках остеосаркомы, обработанных антимицином, комплекс SDH способствовал обратной активности, и включение фумарата 13C3 в сукцинат 13C3 было более значительным, чем сукцинат 13C4 в фумарат 13C4.
