Начните с приготовления достаточного количества электропорационной смеси для контроля и интересующего гена. Подключите электродную камеру чашки Петри к электропоратору. Затем, используя наконечники Microloader, заполните иглы для микроинъекций 8 микролитрами каждой смеси для электропорации.
Обрежьте кончики игл перед использованием, чтобы добиться стабильного потока с помощью тонких ножниц. Убедитесь, что вы удалили только небольшую часть наконечника, так как тупой и широкий наконечник может серьезно повредить органоиды. Под микроскопом выберите пять церебральных органоидов с гладкими границами и видимыми желудочкоподобными структурами.
Затем переместите их в 35-миллиметровую чашку для культивирования клеток, содержащую предварительно разогретый DMEM/F-12, используя отрезанный наконечник пипетки объемом 1000 микролитров. Теперь осторожно вставьте иглу через стенку желудочкообразной структуры и вливайте ее электропорационной смесью до видимого заполнения. Не оказывайте чрезмерного давления на желудочкоподобные структуры, чтобы избежать разрыва.
Перенесите один микроинжектированный церебральный органоид в электродную камеру чашки Петри с небольшим количеством DMEM/F-12. Расположите органоид так, чтобы поверхности микроинъекционных желудочкообразных структур были обращены к электроду, соединенному с положительным полюсом электропоратора. Теперь электропорируйте церебральные органоиды один за другим, используя пять импульсов по 80 вольт в течение 50 миллисекунд каждый с интервалом в одну секунду.
Если микроинъекция и электропорация проводились в нестерильных условиях, переместите электропорированные органоиды под колпаком с ламинарным потоком в новую 35-миллиметровую чашку для культивирования клеток, заполненную предварительно подогретым DMEM/F-12. Затем культивируют электропорированные органоиды в СД с витамином А на орбитальном шейкере при 55 об/мин в гумифицированной атмосфере с содержанием 5% углекислого газа и 95% воздуха при 37 градусах Цельсия. На следующий день, после электропорации, проверьте церебральные органоиды на успешную электропорацию под обычным инвертированным флуоресцентным микроскопом.
Перенесите электропорированные органоиды в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров с помощью отрезанного наконечника пипетки объемом 1000 микролитров и удалите лишнюю среду. Добавьте достаточное количество 4% параформальдегида в DPBS и выдерживайте в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации аспирируют параформальдегид.
Затем добавьте 5 миллилитров DPBS, осторожно встряхните и аспирируйте DPBS. Храните органоиды в DPBS при температуре 4 градуса Цельсия до дальнейшего использования. Через два дня после электропорации GFP-положительные клетки почти исключительно локализуются в желудочковой зоне и являются положительными на Pax6, что указывает на то, что эти клетки являются апикальными предшественниками или базальными предшественниками новорожденных.
Через 10 дней GFP-положительные клетки локализуются в базальных областях. Эти клетки также положительны на Pax6 или NeuN, что свидетельствует о базальных предшественниках или нейронах соответственно. Показана 3-D реконструкция электропорированных церебральных органоидов для получения впечатления 3-D распределения GFP-положительных клеток.
