Для начала возьмите пластину с электропорированными фибробластами и наблюдайте за образованием колоний hiPSC под 10-20-кратным объективным фазовоконтрастным микроскопом. Колонии hiPSC с диаметром 300 микрометров, четкими границами и высоким соотношением ядер к телу подходят для сбора. Перед сбором покройте лунки 96-луночной пластины, подходящей для культуры hiPSC, 100 микролитрами раствора для покрытия.
И инкубировать в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Во время инкубации отметьте интересующие колонии на дне чашки для культивирования клеток ручкой. Для окончательного приготовления 96-луночной плиты удалите раствор покрытия и добавьте в каждую лунку 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды hiPSC, содержащей 10 микромолей ингибитора ROCK Y-27632.
Затем промойте клетки предварительно подогретым PBS и добавьте свежую предварительно подогретую питательную среду hiPSC, содержащую 10 микромолей ингибитора ROCK Y-27632, перед сбором для удаления мертвых клеток. Соберите колонии hiPSC с помощью калибровочной стрелки и разделите колонии на мелкие кусочки, нарисовав сетку в каждой колонии. После этого используйте фазово-контрастный микроскоп, чтобы убедиться, что колонии успешно разделены на части.
Наконец, перенесите колонии с помощью пипетки объемом 100 микролитров в подготовленную пластину с 96 лунками, держа пипетку вертикально над колонией. Дайте клеткам прикрепиться в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа без помех. На следующий день замените среду 200 микролитрами свежей питательной среды hiPSC, чтобы удалить ингибитор ROCK Y-27632 и поместить планшеты обратно в инкубатор.
Следите за 96 скважинами и помечайте скважины успешно отобранными клонами. Отмеченные клоны могут быть расширены и заморожены на этом этапе. Фазово-контрастные изображения успешно перепрограммировали колонии hiPSC, представлены отдельные hiPSCs, спонтанно дифференцированные колонии, колонии без hiPSC и слишком плотная культура hiPSC.
