Начните с того, что положите семи-восьминедельного усыпленного самца мыши на чистую поверхность скамейки. Разрежьте кожу живота мыши ножницами по направлению к нижней части живота. Иссеките жировую ткань с внутренней поверхности бедер.
Поместите иссеченную ткань в пробирку C на льду, содержащую 2,5 миллилитра ферментной смеси ферментов D, R, A и 2,35 миллилитра DMEM/F12 без FBS или антибиотиков. С помощью ножниц разрежьте жировую ткань примерно на два квадратных миллиметра. Плотно закройте крышку трубки C и переверните трубку.
Прикрепите пробирку к рукаву тканевого диссоциатора и переваривайте образцы при 37 градусах Цельсия в течение 40 минут. Затем предварительно разогрейте среду DMEM/F12, содержащую FBS и антибиотики, до 37 градусов Цельсия. После инкубации удалите пробирку C из тканевого диссоциатора и остановите пищеварение, добавив пять миллилитров DMEM/F12 с FBS и антибиотиками.
Аккуратно проведите пипеткой четыре раза. Центрифугируют суспензию по 700 г в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Не нарушая палитру клеток, тщательно аспирируйте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте гранулу в 10 миллилитрах DMEM/F12, содержащего FBS и антибиотики, и аккуратно нанесите пипеткой пять раз. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр диаметром 70 микрон, помещенный в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте фильтрат при 250 г в течение пяти минут.
Ресуспендировать гранулы в 10 миллилитрах PBS. Перед нанесением покрытия центрифугируют суспензию ячейки при 500 г в течение пяти минут. Откажитесь от надосадочной жидкости.
Ресуспендировать гранулы в 10 миллилитрах DMEM/F12, содержащих FBS и антибиотики. Смешайте, пипеткой суспензию аккуратно, 10 раз. Выложите 10 миллилитров суспензии на 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном.
Поместите посуду в инкубатор для клеточных культур. Аспирируйте среду и трижды промойте ячейки тремя миллилитрами PBS за стирку. Добавьте 10 миллилитров DMEM/F12, содержащего FBS и антибиотики, и инкубируйте.
Окрашивание Oil Red O показало насыщенные липидами адипоциты через семь дней после того, как индуцировали дифференцировку адипоцитов. Степень полной дифференцировки подтверждена анализом экспрессии мРНК регуляторов адипогенеза. Росиглитазон индуцировал дозозависимое влияние на уровни экспрессии специфических генов бурого жира, таких как Ucp1 и Ppargc1a.
Однако для Fabp4 эффект насыщен росиглитазоном при концентрации 0,1 мкмоль. Дифференцированные адипоциты могут быть использованы для различных функциональных и механистических анализов, таких как анализ скорости потребления кислорода и иммунопреципитация хроматина.
