Начните с смешивания 200 микролитров восстановленной сывороточной среды с двумя микрограммами любой плазмидной ДНК отдельно в стерильной микроцентрифужной пробирке. Повторите это для двух других плазмид в отдельных пробирках. Затем в новой пробирке смешайте 200 микролитров восстановленной сыворотки с шестью микролитрами реагента для трансфекции и перемешайте содержимое пипеткой.
Инкубируйте пробирки в течение пяти минут при комнатной температуре, прежде чем смешивать содержимое второй пробирки с первой. В отдельных пробирках повторите смешивание двух других плазмид с трансфекционным реагентом. Выдерживайте смесь 20 минут при комнатной температуре.
Затем, по каплям, добавьте трансфекционные комплексы в чашки для визуализации, засеянные клеточными культурами HeLa, обеспечивая равномерное распределение по всей чашке. За час до визуализации откройте клапан резервуара для углекислого газа и включите контроллер окружающей среды для микроскопа. С помощью стрелок вверх и вниз на сенсорной панели отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию и углекислый газ до 5%Нажмите «Установить», когда закончите.
Чтобы настроить параметры лазера, включите лазер белого света, щелкнув вкладку «Получить» и выбрав «Открыть обзор лазера». В диалоговом окне включите лазер белого света. Введите мощность лазера как 85%Нажмите кнопку управления возбуждением и выберите максимальную мощность в раскрывающемся меню.
Начните перколят этилового эфира тетраэтилродамина или TMRE, экспериментируйте, установив лазер возбуждения на 514 нанометров и окно спектров излучения на 524–545 нанометров для YFP. Затем для MitoTracker Deep Red установите лазер возбуждения на 641 и окно спектров излучения на 650-750 нанометров. Аналогичным образом, для TMRE установите лазер возбуждения на 555 нанометров и окно спектров излучения на 557-643 нанометра.
Начните настройку получения изображения, выбрав вкладку «Захват» и изменив формат на 1024 на 1024. Отрегулируйте скорость до 600 в выпадающем меню. Затем нажмите кнопку «Среднее по строке» и в раскрывающемся меню выберите три.
Включите двунаправленное сканирование и установите фазу и коэффициент масштабирования на 22,61 и 1,50 соответственно. После этого выберите ячейки на основе флуоресцентного сигнала YFP, щелкнув одну из настроек YFP и нажав Fast Live. Затем отрегулируйте усиление и интенсивность YFP, а затем выберите ячейки на основе флуоресцентного сигнала YFP.
Чтобы получить изображение контрольной пластины DMSO в эксперименте TMRE, отрегулируйте усиление и интенсивность сигнала TMRE, установив два так, чтобы интенсивность митохондриальной сети была чуть ниже насыщения. Поддерживайте постоянный коэффициент усиления и интенсивность TMRE. Затем отрегулируйте усиление и интенсивность настройки MitoTracker так, чтобы митохондриальная сеть была видна, но тусклая.
После завершения настройки усиления и интенсивности нажмите «Пуск», чтобы получить изображение. Получите изображения 20 клеток в каждом экспериментальном состоянии.
