Приготовьте раствор ОРО, растворив 0,5 грамма порошка ОРО в 100 миллилитрах изопропанола для получения исходного раствора. Приготовьте рабочий раствор для всех мышц, смешав исходный раствор ORO и деионизированную воду в соотношении 60 на 40. Накройте рабочий раствор крышкой на 10 минут, чтобы частицы осели.
Отфильтруйте его через 40-микрометровую сетку, а затем через 0,22-микрометровый шприцевой фильтр. Затем удалите раствор формальдегида из децеллюляризованных мышц в лунку планшета и трижды промойте мышцы равным объемом PBS. Затем замените ПБС равным объемом 60%-ного раствора изопропанола и инкубируйте его на качающемся шейкере в течение пяти минут.
После этого замените 60%-ный раствор изопропанола рабочим раствором ORO перед 10-минутной инкубацией на качающемся шейкере. Затем замените рабочий раствор ORO на равный объем 1% SDS и периодически проверяйте раствор SDS. Как только раствор станет заметно розовым, замените раствор SDS свежим 1%-ным SDS.
Когда раствор останется прозрачным в течение 24 часов, замените 1%-ный SDS на PBS. Под стереомикроскопом с четырехкратным увеличением удалите любой очевидный мусор или частицы, прилипшие к внешней стороне окрашенной мышцы. Если окрашивание удовлетворительное, показывая ярко-красные сферы, плавающие в прозрачной матрице, получают изображения окрашивания с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу.
Правильно децеллюляризованные мышцы были белыми и полупрозрачными. Когда децеллюляризованные мышцы были окрашены ORO для визуализации внутримышечной жировой ткани, или IMAT, липидные капли IMAT были видны в прозрачных мышечных структурах в виде красных сфер. Здоровые мышцы задних конечностей мышей показали немного естественного IMAT, о чем свидетельствует практически полное отсутствие красного или положительного липида по сравнению с мышцами задних конечностей, которым вводили кардиотоксин или глицерин.
Неполная децеллюляризация была выявлена сразу после первичной обработки SDS или после вымывания окрашивания ORO в виде полунепрозрачных светло-розовых волокон. Неполный клиренс РВК был идентифицирован после вымывания РВК в виде розового или красного однородного фона, а не отдельных волоконных линий.
