Обработка свежей первичной опухолевой ткани для создания опухолевых органоидов и первичных фибробластов

Начните с помещения ткани в стерильную планшет для культуры тканей и удаления излишков среды. Измерьте ткань стерильной металлической линейкой и сфотографируйте ее. Добавьте три миллилитра усовершенствованного фильтрующего материала DMEM/F-12 в разрезанную ткань и пипеткой вверх и вниз, чтобы промыть ее.

Затем промойте салфетку тремя миллилитрами PBS. Отсадите среду из планшета для культуры тканей и разрежьте ее на мелкие кусочки с помощью стерильных лезвий и двух миллилитров среды для пищеварения. Затем соберите ткань в 50-миллилитровую пробирку, содержащую в общей сложности пять миллилитров среды для пищеварения.

Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Периодически перемешивайте суспензию пипетированием вверх и вниз. Инактивируйте трипсин, добавив в пробирку пять миллилитров усовершенствованного DMEM/F-12.

Затем отфильтруйте образец через фильтр с порами 70 микрометров, чтобы удалить крупный мусор. Теперь нанесите пипеткой два миллилитра DMEM, содержащего 10% FBS, в верхнюю часть фильтра и используйте пипетку для сбора мусора и остатков тканей для культивирования фибробластов. Затем насыпьте обломки для культивирования фибробластов.

Центрифугируйте фильтрат при комнатной температуре от 200 до 300 G в течение пяти минут, а затем аспирируйте надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу пять миллилитров усовершенствованного DMF 12 и снова центрифугируйте суспензию при 300 G в течение пяти минут. Для лизиса эритроцитов суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах буфера для лизиса хлорида аммония и переложите ее в 15-миллилитровую пробирку.

Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение двух минут. После центрифугирования смеси в тех же условиях, которые были продемонстрированы ранее, аспирируйте надосадочную жидкость. К грануле добавьте пять миллилитров усовершенствованного DMEM/F-12, и снова центрифугируйте при четырех градусах Цельсия.

После аспирации надосадочной жидкости добавьте в гранулу один миллилитр имеющегося в продаже реагента для диссоциации клеток и инкубируйте ее в течение двух-трех минут при комнатной температуре. После инкубации центрифугируйте и еще раз отасуньте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах усовершенствованного DMEM/F-12.

Диссоциируйте клеточные комки путем многократного пипетирования суспензии с помощью пипетки P1000. Центрифугируйте суспензию и удалите надосадочную жидкость. Затем приобретите предварительно охлажденные наконечники для пипеток P1000 и P200 и используйте холодные наконечники, закрепленные на пипетке P1000, для ресуспендирования клеточной гранулы в мембранной матрице, прежде чем поместить Falcon на лед, чтобы предотвратить затвердевание.

Достаньте предварительно подогретую пластину из инкубатора. Используя набор дозаторов P200 объемом 48 микролитров и с помощью холодных наконечников, создайте купола матрицы базальной мембраны в предварительно нагретой пластине. Затем инкубируйте его до затвердевания базальной мембранной смеси.

Как только матрица застынет, добавьте от двух до двух с половиной миллилитров усовершенствованного DMEM/F-12, дополненного факторами роста и ингибиторами. Опухолевые клетки были изолированы, и опухолевые органоиды были выделены из свежих тканей в течение 15-дневного периода. Иногда большие объемы клеточного мусора препятствуют точной визуализации развивающихся опухолевых органоидов.

Было замечено, что развивающиеся органоиды фенотипически варьируют от изолированных, округлых до сфероидных или агрегатообразных культур, в зависимости от происхождения опухоли. Органоидные культуры могут быть контаминированы фибробластами, распространенным продуктом PI культуры клеток первичной опухоли. Примерно через семь дней культивирования фибробласты мигрируют из куполов матрицы базальной мембраны и прилипают к клеточным пластинам, что может поставить под угрозу оптимальный рост органоидов.

Культуры фибробластов устанавливаются из остатков ткани, извлеченных из фильтра. Клетки мигрируют из остатков ткани и прилипают к культуральным планшетам.