Для начала поместите мышей под наркозом на операционную платформу. После стрижки волос нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить их высыхание. Затем закрепите мышей на стереотаксическом аппарате для иммобилизации.
Сделайте небольшой разрез под микроскопом, чтобы полностью обнажить череп. Подготовьте два шприца объемом 10 микролитров, один из которых содержит шРНК рецептора AAV2/5-аденозина 2А, а другой — скрембл AAV2/5. Затем с помощью микроскопа определите местоположение брегмы и лямбды и установите координатную точку на шприце объемом 10 микролитров на основе стереотаксического атласа мозга мыши.
Просверлите небольшое отверстие в черепе в установленной координатной точке. Введите два микролитра вируса шРНК рецептора AAV2/5-аденозина 2А в желудочек головного мозга путем боковой инъекции с постоянной скоростью 100 нанолитров в минуту. Удерживайте иглу на месте в течение 10 минут перед извлечением.
Своевременно запечатайте поврежденную кожу с помощью медицинского биофибринового клея, чтобы предотвратить потерю вируса. Поместите мышь на грелку, поддерживая температуру ее тела примерно на уровне 37 градусов по Цельсию, чтобы облегчить восстановление. Введите два микролитра рекомбиназы CRE-TAT в каждый боковой желудочек мыши томата Arosa L-D-L-T-D для экспериментальной группы и два микролитра стерильной PBS для контрольной группы.
Через две недели после инъекции рекомбиназы CRE-TAT подготовьте замороженные срезы тканей, выполните ядерное окрашивание и подготовьте предметное стекло для визуализации Сбивание рецептора аденозина 2A в сосудистом сплетении у гомозиготных аденозиновых рецепторов 2A мыши с использованием CRE-TAT привело к снижению клинических показателей EAE. Аналогичным образом, сбивание сосудистого сплетения у мышей дикого типа с рецептором аденозина 2А с использованием шРНК AAV2/5 снижало клинические баллы EAE. Анализ QPCR показал, что уровни мРНК рецептора аденозина 2А снижались в группах AAV2/5 shRNA и CRE-TAT по сравнению с каждым контролем.
Сайленсинг рецептора аденозина 2А, особенно в сосудистом сплетении, снижает инфильтрацию иммунных клеток в спинной мозг.
