Начните с подсоединения трубки микроперфузионного аппарата к чипхолдеру. Промойте катетку с помощью базового секретагога, например, двухмиллимолярной глюкозы, в течение пяти минут. Отсасывайте лишнюю жидкость из верхнего и нижнего клапанов микрочипа.
Верхняя половина микрочипа обеспечивает надлежащую герметизацию лунок, в то время как нижняя половина содержит лунки с прикрепленным стеклозащитным стеклом. Далее предварительно смочите лунку пятью микролитрами ДМЭМ. Пипеткой оберните внешние края лунки, чтобы смочить щели.
Сделайте снимки светлого и темного поля культивируемых человеческих псевдоглазков, выделенных из первичных глаз поджелудочной железы человека. С помощью предварительно смоченной пипетки соберите от 30 до 32 псевдоглазков в 23 микролитрах среды и медленно распределите их в центр лунки микрочипа. Убедитесь, что на наконечнике пипетки не осталось ложных проушин.
Используйте гелевый наконечник для загрузки, чтобы аккуратно переместить псевдопроушины в центр лунки для максимального обзора поля. Сделайте стереоскопическое изображение псевдоглазков в микрочипе, чтобы скорректировать потери ложных глазков. Если все псевдопроушины с пластины не загружены в микрочип, отрегулируйте количественное определение эквивалента проушины соответствующим образом.
Поместите нижнюю часть микросхемы в держатель, затем осторожно поместите верхнюю часть микросхемы зеленой прокладкой вниз. Удерживая микросхему на месте, закройте держатель, чтобы зажать микросхему вместе. Перенесите секретограммы, насос и микрочип в держателе в климатическую камеру, установленную на конфокальном микроскопе, и направьте трубку оттока из камеры в коллектор фракций.
Поместите буферы в конические пробирки объемом 15 миллилитров с отверстиями, просверленными в их крышках, чтобы предотвратить смещение трубок. Отделите гайку и наконечник. Затем вкрутите трубку в дебаблер, чтобы предотвратить скручивание лески.
Затем настройте сборщик фракций на вращение каждые две минуты. Затем загрузите в него соответствующее количество трубок, учитывая смывки и экспериментальные фракции. Запустите насос для подачи исходной глюкозной среды со скоростью 100 микролитров в минуту.
Следите за каплями в конце носика коллектора фракций, указывающих на протекание системы. Снижение оттока системы, как видно на трубке, помеченной красным крестиком, указывает на засорение системы или утечку. После того, как будет установлен постоянный поток среды, поверните головку сборщика фракций для дозирования в трубки и запустите коллектор фракций.
Соберите первые 15 фракций смывателя, чтобы дать возможность ложным люверсам сбалансироваться. Обеспечив непрерывный и точный поток среды, выбросьте смывки. Пока собираются смывки, настройте микроскоп для визуализации живых клеток.
Установите объектив в положение U Plan Fluorite 20X с 1-кратным зумом. Флуоресцентные каналы к EGFP с излучением 510 нм. Длина волны лазера до 488.
И длина волны детектирования до 500-600 нанометров. Установите временной ряд так, чтобы изображение получалось каждые две секунды в течение всего эксперимента, а скорость выборки равнялась двум микросекундам на пиксель. Теперь определите нижнюю часть псевдолюверсов в поле зрения и отрегулируйте фокальную плоскость на 15 микрометров выше этого положения, рамку для использования на протяжении всей визуализации.
После завершения промывки нажмите кнопку «Старт» в программном обеспечении для обработки изображений, когда коллектор фракций перейдет к первой фракции, и соберите сточные воды в пробирки объемом 1,5 миллилитров. В нужное время вручную переключите трубку с базового буфера на новую буферную трубку стимула. Поместите первые 10 коллекций при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы предотвратить деградацию гормонов, и продолжайте следить за потоком системы, проверяя объем сточных вод в каждой пробирке.
После завершения эксперимента переключитесь обратно на исходную среду, позволив насосу промыть буфер стимула в течение пяти минут. Остановите насос и отсоедините трубку держателя микрочипа на дебаблере и коллекторе фракций. Закройте все дверцы климатической камеры, чтобы поддерживать температуру.
Храните перфузаты при температуре 80 градусов Цельсия для последующего анализа на гормоны. Осторожно откройте держатель микрочипа и снимите верхнюю часть микрочипа. Сделайте окончательное микроскопическое изображение псевдоглазков в микрочипе перед удалением, чтобы отрегулировать IEQ экстракта глазков.
С помощью пипетки и микроскопа перенесите псевдолюверсы из лунки в 1,5-миллилитровую трубку. Убедитесь, что все псевдолюверсы были собраны с помощью микроскопа. Дважды умыться с 500 микролитрами PBS.
Затем вращайте ложные люверсы в течение одной минуты при 94G между каждым мытьем. После аспирации надосадочной жидкости добавьте 200 микролитров кислотного этанола и храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день центрифугируйте экстракты.
Затем аликвотируем 45 микролитров надосадочной жидкости в три новые пробирки. Храните пробирки при температуре 80 градусов Цельсия для анализа содержания гормонов. Трансдуцированные клетки человеческих глазков показали реагрегацию с течением времени с полностью сформированными псевдоокнами глаз, образовавшимися через шесть дней культивирования.
Клетки начали проявлять видимую флуоресценцию cADDis в течение 48 часов, а к концу периода культивирования в трансдуцированных клетках наблюдалась высокая экспрессия биосенсоров. Псевдопроушины показали среднюю эффективность трансдукции 60% в альфа-клетках и 95% в бета-клетках. Визуализация живых клеток и микроперфузионная установка способствовали синхронному сбору внутриклеточной динамики цАМФ с помощью флуоресценции cADDis и секреции гормонов.
Воздействие двухмиллимолярной глюкозы приводило к низкой и стабильной относительной интенсивности cADDis и секреции инсулина. Достоверное увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ наблюдалось при воздействии на клетки 20-миллимолярной глюкозы и IBMX. Это сопровождалось повышением инсулина и глюкагона.
Воздействие на псевдоглазки двухмиллимолярной глюкозы и адреналина увеличивало внутриклеточную концентрацию цАМФ, что ассоциировалось с повышением глюкагона.
