Для начала тщательно распылите на убитого 10-недельного самца мыши C57 black 6J 70% этанола. С помощью щипцов снимите кожу с задней конечности и рассеките все мышцы конечностей, окружающие бедренную, большеберцовую и малоберцовую кости. Поместите собранные мышцы конечностей в двухмиллилитровую трубку, содержащую один миллилитр буфера для изоляции мышц.
И с помощью ножниц пропустить через мясорубку собранные мышцы. Перелейте измельченную мышечную суспензию в 50-миллилитровую трубку, содержащую 18 миллилитров изолирующего буфера для мышц. Плотно закройте пробирку, запечатайте ее лабораторной пленкой и поместите горизонтально на водяную баню.
Через 30 минут добавьте пять миллиграммов коллагеназы I типа и держите трубку еще 30 минут. После пипетирования мышечной суспензии вверх и вниз 10 раз центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, оставив в пробирке пять миллилитров среды. Нанесите пипетку суспензии на последовательные клеточные фильтры и соберите поток в 50-миллилитровую пробирку.
Центрифугируйте суспензию и выбросьте надосадочную жидкость до тех пор, пока в пробирке не останется всего от 100 до 200 микролитров. Ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте на льду в течение трех минут. Снова центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость из пробирки с помощью пипетки объемом от 20 до 200 микролитров.
Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах холодного буфера FACS и поместите трубку на лед. После удаления 10 микролитров клеточной суспензии для отрицательного контроля центрифугируйте оставшиеся 90 микролитров и выбросьте надосадочную жидкость перед инкубацией клеток с 400 микролитрами корректируемого окрашивания жизнеспособности, разведенными в бессывороточном DMEM в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования добавьте 100 микролитров буфера FACS и аккуратно переверните пробирку трижды.
Снова центрифугируйте и добавьте в пробирку 100 микролитров первичной смеси антител. После 30 минут инкубации в темноте центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 500 микролитров PBS для промывания клеток.
Снова центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать гранулу в 500 микролитрах буфера FACS. Переложите суспензию в пятимиллилитровую трубку. Кратковременно переведите клеточную суспензию в вихрь перед обработкой ее на проточном цитометре.
Соберите выбранные клетки в пятимиллилитровую пробирку, содержащую буфер FACS. 75% мононуклеарных клеток, идентифицированных на основе их размера и зернистости, были отрицательными по маркеру окрашивания на корректируемую жизнеспособность, что в среднем составило 34,3% живых клеток. Около 3% одиночных живых клеток были отрицательными по моноцитарным, эндотелиальным, лейкоцитарным и эритроидным специфическим маркерам.
Затем эти негативные клетки отбирали в соответствии с их экспрессией маркеров CD34 и ITGA7. Было проведено окончательное стробирование для CXCR4 для выбора предполагаемых сателлитных ячеек. А из CD34-положительных ITGA7-положительных клеток 80% были обнаружены положительными на CXCR4.
