Чтобы начать анализ с использованием агониста тромбоцитарных рецепторов, Collagen-Related Peptide Cross-Linked, или CRPXL, разбавляют соответствующее количество запаса CRPXL в буфере для анализа до концентрации, подходящей для индуцирования максимальной агрегации тромбоцитов. Полученное решение в дальнейшем будет называться стандартом. Далее, начиная с тех же самых высоких подготовленных концентраций, последовательно выполняют двукратные серийные разведения как для стандартного, так и для исследуемого реагента.
Подготовьте серию разведения по шести-восьми пунктам как для теста, так и для стандарта в буфере для анализа, которая генерирует агрегационные реакции от 100% до 0%Когда обогащенная тромбоцитами плазма, или PRP, готова к использованию, добавьте аликвоту PRP в кювету агрегометрии светопропускания. Дайте образцам нагреться до 37 градусов Цельсия в лунках для выдержки в течение пары минут. После соответствующего нагрева поместите кюветы в агрегатометр, чтобы начать запись следов.
При постоянном помешивании добавьте агонист, и запишите данные. Выполните сбор данных для каждого приготовленного разведения стандарта и исследуемого реагента. Используйте Graphpad Prism или любой подходящий пакет программного обеспечения, чтобы убедиться, что кривые концентрации для стандарта и теста параллельны.
Введите данные таким образом, чтобы ось x содержала концентрации, а ось y — ответы, обозначенные либо процентом максимальной агрегации, либо площадью под кривой. Затем преобразуйте значения концентрации в соответствующие логарифмы, или логарифмическую концентрацию. Выберите нелинейную регрессию из функций анализа и используйте уравнение для стимуляции зависимости от дозы.
Выберите наклон логарифмического агониста в зависимости от переменной отклика и используйте трех- или четырехстороннюю аппроксимацию, в зависимости от того, что лучше всего подходит для данных. Определите, параллельны ли созданные кривые, щелкнув вкладку сравнения и сравнив наборы данных. Убедитесь, что наклон и асимптоты теста, а также стандартные кривые эквивалентны.
Если эти условия выполнены, перейдите к расчету потенции, или EC50, с использованием подгонки кривой нелинейной регрессии. Рассчитайте относительную эффективность, разделив значение EC50 стандарта на значение теста. Отрегулируйте массовую концентрацию испытуемого реагента с учетом разницы в эффективности по отношению к стандарту.
Трассировки агрегации тромбоцитов для стандартного и исследуемого реагентов выявили разницу между двумя реакциями на агрегацию. При 0,075 микрограмма на миллилитр наблюдалась четкая реакция на стандарт, в то время как для теста соответствующая концентрация не показала никакой реакции. Значения EC50 стандартного и исследуемого реагента рассчитывали путем построения кривой реакции концентрации.
