Для начала введите обезболивающую подкожно крысе, которой ранее вводили внутрицеребровентрикулярно с высвобождающим коктейлем. Установите крысу на стереотаксическую раму. Закрепите голову с помощью ушных вкладышей, чтобы не препятствовать вращательному движению вперед и назад.
Стабилизируйте голову вниз под углом 40 градусов, чтобы правильно вытянуть заднюю часть шеи. Сбрейте шерсть шеи с помощью бритвы и продезинфицируйте кожу тремя чередующимися циклами 10%-ного повидон-йода и спирта с помощью стерильных ватных тампонов, растирая в разных направлениях в течение трех-пяти секунд каждый раз. Кончиком пальца определите вдавленную область округлой формы между затылочным выступом и позвоночником атланта.
Отметьте эту точку маркером. Прикрепите шприц объемом один миллилитр к стереотаксической рамке. Расположите иглу так, чтобы она соприкасалась с кожей на отметке.
С помощью щипцов приподнимите кожу, вводя шприц через слои кожи. Осторожно потяните поршень назад, чтобы создать отрицательное давление внутри шприца. Постепенно вводите иглу до тех пор, пока в шприце не станет видна спинномозговая жидкость.
Удерживайте иглу в этом положении и позвольте медленно течь спинномозговой жидкости. Медленно удаляют спинномозговую жидкость объемом до 120 микролитров. Осторожно извлеките шприц.
Введите один миллилитр нормальной сыворотки внутрибрюшинно, чтобы поддержать восполнение жидкости экспериментальным животным. Соедините жидкую биопсию с 400 микролитрами среды нейральных стволовых клеток и храните микроцентрифужную пробирку при температуре четыре градуса Цельсия для последующего использования. Затем переведите животное в зону послеоперационного мониторинга.
Доильная биопсия привела к получению культур нейральных стволовых клеток со средним потенциалом пассажа 3,17, достигая даже девяти пассажей. Собранные клетки помещали на лунки, покрытые поли-D-лизином, где они росли как в виде адгезивных монослоев, реже в виде нейросфер. Свежевыделенные клетки, которые были GFAP-положительными, также были иммунопозитивными для маркера покоя ID3 и имели характеристику биполярной морфологии NSE.
Иммуноцитохимическое сравнение клеток, полученных из биопсии и посмертно, показало, что профиль собранных клеток был сходен с клетками эндогенной субэпендимальной зоны. Фактор роста приводил к сопутствующему и значительному увеличению клеток SOX2 и снижению двойных кортин-положительных нейробластов в обоих образцах.
