Для начала возьмите подготовленные субмитохондриальные везикулы дрожжей и центрифугируйте образовавшиеся везикулы и оставшиеся неповрежденные митохондрии при 20 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Интактные митохондрии сформировали гранулу, в то время как везикулы остаются в надосадочной жидкости. Затем перелейте надосадочную жидкость в свежие ультрацентрифугирующие пробирки.
Загрузите на дно пробирки подушечку из 0,3 миллилитра 2,5 молярного раствора сахарозы с помощью шприца объемом один миллилитр, оснащенного канюлей, и центрифугируйте при 118 000 G в течение 100 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования везикулы будут выглядеть в виде диска на верхней части подушки сахарозы. Выбросьте примерно 90% надосадочной жидкости.
Чтобы собрать концентрированные везикулы, ресуспендируйте их в оставшемся буфере, включая 2,5-молярную сахарозу, путем пипетирования. Перелейте суспензию в ледяной гомогенизатор Dounce и гомогенизируйте суспензию с помощью политетрафторэтиленового гончара не менее чем за 10 ходов. Далее приготовьте ступенчатый градиент объемом 11 миллилитров, при этом каждый слой содержит 2,2 миллилитра раствора сахарозы.
Рассчитайте концентрацию сахарозы по этой формуле. Добавьте самую высокую концентрацию сахарозы в центрифугированную пробирку и поместите ее при температуре минус 20 градусов Цельсия, пока слой полностью не замерзнет. Измерьте концентрацию сахарозы в образцах с помощью рефрактометра.
Если рефрактометр недоступен, предположим, что концентрация сахарозы составляет 2 моляра. Чтобы довести концентрацию сахарозы до 0,6 моляров, добавьте соответствующий коктейль MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F и коктейль ингибиторов протеазы при pH 7,4. Осторожно нагружайте образцы на градиент сахарозы, чтобы избежать нарушения градиента.
Центрифугируют везикулы при температуре 200 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 12 часов. По возможности установите медленное ускорение и замедление, чтобы избежать нарушения градиента. Затем соберите градиент сверху вниз фракциями по 700 микролитров с помощью пипетки объемом один миллилитр.
В результате получается 17 дробей, что обеспечивает достаточную разрешающую способность. Затем выполняют два последовательно выполненных осаждения трихлоруксусной кислоты, добавляя 200 микролитров 72%-ной трихлоруксусной кислоты к отдельным фракциям и перемешивая до получения однородного раствора. Инкубируйте фракции в течение 30 минут на льду и гранулируйте осажденные белки центрифугированием при 20 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 500 микролитров 28%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Хорошо перемешайте и повторите этап центрифугирования.
Наконец, проанализируйте фракции с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Здесь представлена важность мягкого ультразвукового воздействия. Маркер митохондриальной внешней мембраны Tom40 был обогащен в ранних фракциях с низкой плотностью и практически отсутствовал в более поздних.
Маркер внутренней мембраны митохондрий Tim17 был сконцентрирован во фракциях высокой плотности. Напротив, в белке контактного сайта Mic60 накапливались нарушения промежуточной концентрации сахарозы, что свидетельствует об успешном образовании и последующем разделении различных мембранных везикул. Напротив, в более жестких условиях ультразвуковой обработки маркер внешней мембраны митохондрий Tom40 может быть обнаружен в более низких фракциях градиента.
Кроме того, было выявлено значительное количество нарушений Tim17 промежуточной плотности.
