Для начала разморозьте запас ретровируса RCAS(A)на льду. Чтобы избежать засорения микропипетки, центрифугируйте раствор при 10 000 G в течение 10 секунд при четырех градусах Цельсия и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку, держа растворы на льду. Поместите натянутую лабораторную парапленку на чашку для клеточных культур размером 35 на 10 миллиметров и добавьте в парапленку один микролитр стерильного PBS.
Подключите подготовленную стеклянную микропипетку к автоматическому инжектору Pico. Нажмите режим заполнения, чтобы заполнить PBS в микропипетку, а затем нажмите режим инжекции, чтобы проверить выделенный один микролитр жидкости. Поместите второй кусок натянутой лабораторной парапленки на новую чашку для клеточных культур и добавьте в пленку один микролитр быстро окрашенного зеленого вирусного материала.
Опустите кончик микропипетки в вирусный запас и нажмите режим заполнения, чтобы заполнить микропипетку одним микролитром вирусного запаса. Под препарирующий микроскоп опустите наполненную микропипетку, соединенную с автоматическим инжектором, в целевую область хрусталика куриного эмбриона. Затем отрегулируйте источник света, чтобы обеспечить четкий обзор пузырька объектива.
Убедившись, что микропипетка находится в правильном месте внутри просвета линзы, введите от пяти до 40 нанолитров вирусного запаса. После инъекции подождите 45 секунд, прежде чем аккуратно извлечь микропипетку. Далее проверьте успешность микроинъекции, исследуя быстрый зеленый краситель в пустом просвете хрусталика без утечки.
После осмотра заклейте отверстие яичной скорлупы скотчем и поместите яйца в увлажненный статический инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. В этом исследовании демонстрируется гистологическая оценка химерных петель коннексона 50 и 43 с помощью иммунофлюоресценции. С помощью мечения Anti-Flag экзогенные коннексоны отличались от эндогенных.
В исследовании также оценивается взаимодействие между внутриклеточным петлевым доменом коннексона 50 и Аквапорина ноль.
