Для начала возьмите один миллилитр культуры дрожжевых клеток в середине логарифмической фазы, экспрессирующей HyPer7, нацеленный на митохондрии. Центрифугируйте клетки при 6000 G в течение 30 секунд и удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке от 10 до 20 микролитров. Повторно суспендируйте клеточную гранулу, аккуратно перемешав ее с остаточной средой с помощью микропипетки.
Затем с помощью воздуходувки или безворсовой салфетки очистите предметное стекло микроскопа и добавьте на предметное стекло 1,8 микролитра клеточной суспензии. Наконец, накройте ячейки стеклом под номером 1,5, медленно опустив его под углом, чтобы избежать появления пузырьков. Затем поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа.
Чтобы получить изображение ячеек, настройте условия съемки, чтобы обеспечить обнаруживаемый сигнал и приемлемое разрешение в каждом канале флуоресценции. Например, на конфокальном микроскопе с вращающимся диском и камерой sCMOS используйте биннинг 2x2, мощность лазера от 20 до 40% и выдержку от 200 до 600 миллисекунд. Далее изучите гистограмму изображения.
В 12-битном изображении убедитесь, что общий динамический диапазон значений пикселей составляет не менее нескольких сотен уровней серого без насыщенности. Кроме того, убедитесь, что дальность действия на порядок выше уровня шума. Чтобы рассчитать уровень шума, измерьте стандартное отклонение значений пикселей в области изображения, не содержащей ячеек.
Затем соберите покадровые изображения без задержки между съемками, чтобы оценить влияние условий визуализации на стабильность сигнала и окислительный стресс в митохондриях. С помощью программного обеспечения для сбора данных микроскопа или ImageJ измерьте среднее значение пикселя в каждом канале флуоресценции, чтобы обеспечить стабильность сигнала. Если эксперимент не включает в себя покадровую визуализацию, убедитесь, что флуоресценция стабильна на двух или трех повторяющихся Z-стеках.
Получение изображений с интервалом Z 0,5 микрометра при общей глубине стека шести микрометров для почковающихся дрожжей. При сборе Z-стеков убедитесь, что интервал Z одинаков для всех изображений в наборе данных и включает всю ячейку. Также получайте изображения проходящего света для документирования границ ячеек.
