Начните с трипсинизации мезенхимальных стволовых клеток человека для создания клеточной суспензии. Далее аликвотируем клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую пробирку, чтобы создать 10 конструкций. После центрифугирования суспензии при 220г в течение трех минут используйте вакуумный насос для удаления надосадочной жидкости.
Теперь поместите гранулу ячейки на лед. Затем доведите до комнатной температуры бутылки с тиол-модифицированной гиалуроновой кислотой, тиол-реактивным сшивателем, диакрилатом полиэтиленгликоля и дегазированной водой. В стерильных условиях с помощью шприца, оснащенного иглой, добавьте один миллилитр дегазированной воды в бутылку, содержащую гиалуроновую кислоту.
Вортейте раствор, периодически нагревая его до 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока он не станет прозрачным. Затем поместите раствор на лед. В стерильных условиях добавьте в флакон сшивающего агента 5 миллилитров дегазированной воды.
Растворите, многократно перевернув, прежде чем положить его на лед. Теперь добавьте 120 микролитров растворенного раствора гиалуроновой кислоты в аликвотированную клеточную гранулу и ресуспендируйте клеточную гранулу, пипетируя раствор вперед и назад. Добавьте 30 микролитров растворенного раствора сшивающего агента в пробирку с ресуспензионной клеточной гранулой.
Убедитесь в правильном перемешивании, постукивая по трубке. После перемешивания ненадолго раскрутите раствор. Капните 15 микролитров комбинированного раствора на 24-луночный планшет, покрытый парафином.
Дайте ему застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Для дифференцировки in vitro добавьте 0,5 мл хондрогенной дифференцировочной среды в гидрогели, находящиеся в клетках. Через три недели переключитесь на среду гипертрофической дифференцировки, добавив по 0,5 миллилитра на лунку.
Хондрогенная дифференцировка привела к получению сульфатированных гликозаминогликанов в коллагеновом положительном внеклеточном матриксе 2-го типа как в гиалуроновой кислоте или ГК, так и в коллагеновых конструкциях. Тем не менее, распределение было более однородным в конструкциях гиалуроновой кислоты. Коллагеновые конструкции продемонстрировали периферические клетки с гетерогенной морфологией.
Средняя округлость клеток в конструкциях с ГК была выше, чем в коллагеновых конструкциях. Отложение кальция было обнаружено на внешних краях обеих конструкций через пять недель. В конструкциях с гиалуроновой кислотой in vivo все имплантаты прикреплялись друг к другу в подкожных карманах и образовывали интегрированную костную ткань.
40% коллагеновых конструкций in vivo были независимыми. Остеоидная ткань с пластинчатой морфологией была сформирована во внешних областях обоих конструкций in vivo через восемь недель после имплантации. Потеря хряща также наблюдалась в конструкции HA.
Множественные конструкции с гиалуроновой кислотой in vivo, по-видимому, образуют интегрированную костную ткань, на что указывает соединение с костными тканями и наличие фиброзной ткани суставов. В то время как 40% коллагеновых конструкций были объединены, остальные конструкции существовали отдельно или были прикреплены только без соединений костной ткани. Обе конструкции показали положительно меченые сосуды в костном мозге, а внутренний хрящ был окружен многоядерными остеокластными клетками.
Минерал был отложен во внешней остеоидной области как конструкций с большим объемом минерала, так и конструкций ГК из-за их большего размера.
