Анализ экспрессии белка в клетках MCF-7, обработанных салидрозидом, методом вестерн-блоттинга

Начните с добавления двух миллилитров клеток MCF-7, содержащих различные препараты, в лунки шестилуночного планшета. Инкубируйте клеточные культуры в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Соберите клетки центрифугированием при температуре 560 x g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Затем дважды промойте ячейки с помощью предварительного охлаждения PBS, центрифугируя при давлении 560 x g в течение трех минут между промывками. Добавьте в промытые клетки 50 микролитров буфера для лизиса и поместите образец в ледяную баню на 15 минут. Затем центрифугируйте образец при 8 550 х г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите образец белка надосадочной жидкости.

Соедините образец белка с загрузочным буфером в соотношении четыре к одному. Далее денатурируйте смесь при температуре 100 градусов Цельсия в течение 10 минут в металлической ванне. Затем остудите смесь до комнатной температуры.

Отделите образец белка с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с 10% SDS. Перенесите белки на мембрану из PVDF толщиной 0,22 микрометра. После блокирования мембраны 5% БСА инкубируйте ее с соответствующими первичными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

На следующий день инкубируйте мембрану с козьим вторичным антителом IgG против кролика при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. Затем проявите мембраны с помощью хемилюминесцентного раствора ECL и получите изображения с помощью бесконтактной системы количественной визуализации вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг показал, что лечение салидрозидом способствует экспрессии белков проапоптотических факторов CC-9, CC-7, CC-3, Bim и Bax, в то время как оно ингибирует экспрессию белка антиапоптотических BCL-2.

Салидрозид заметно ограничивал отношения p-PI3K к PI3K и p-AKT к AKT. Между тем, экспрессия белков mTOR, HIF-1 альфа и Fox01 также была заметно подавлена.