После создания и юстировки поляризационно-чувствительной двухфотонной микроскопической системы, согласно показанному схематическому изображению, проверьте качество юстировки оптики с изотропным эталонным образцом, таким как флуоресцеин, воплощенным в аморфном полимере. Для этого включите возбуждающий лазер и измерьте 360-градусные полярные графики эталонного образца для нулевой полуволновой пластины. Отрегулируйте угол полуволновой пластины в соответствии с осями X и Y плоскости образца и проверьте, собирают ли оба фотодиода одинаковые интенсивности двух возбуждаемых фотонами компонент излучения.
Для анализа образца установите предметное стекло с этим сферулитовым образцом на пьезоэлектрический столик, убедившись, что поверхность предметного стекла, содержащего защитное стекло, обращена к объективу с высокой числовой апертурой. Затем закрепите предметное стекло скотчем. Затем, регулируя положения X, Y и Z с помощью ручек микроскопа, сфокусируйте объектив на сферулите в растворе.
Сосредоточьтесь именно на центральной области всей конструкции, так как диаметры сферулита обычно находятся в диапазоне десятков микрон. Затем центрируйте этот сферулит в поле зрения в плоскости микроскопа. Определите размер сканирования XY, регулируя количество ступеней пьезостолика в направлениях X и Y, чтобы покрыть всю площадь конструкции.
Отрегулируйте параметры пьезостолика, такие как скорость сканирования, размер шага и диапазон, чтобы покрыть площадь всего сферулита. Откройте затвор, включите фотодиоды и соберите компоненты излучения X и Y интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции для каждого отдельного шага выбранной области сканирования для возбуждающего луча, поляризованного в соответствии с осями X, а затем Y. Затем отсканируйте этот образец сферулита, в результате чего получится двухфотонная возбужденная флуоресценция.
Чтобы выполнить полный поляризационный анализ с определенной точки на образце, выключите возбуждающий луч. Возьмем конкретные координаты пьезостадии, соответствующие выбранному положению на этом сферулите, где требуется информация об ориентации молекул с субмикронным разрешением. Настройте пьезоэлектрический столик так, чтобы он центрировал поле зрения по указанным координатам X и Y.
После включения возбуждающего луча включите вращение полуволновой пластины на 180 градусов, чтобы выполнить полный поляризационный анализ на 360 градусов компонентов излучения X и Y двухфотонного возбужденного флуоресцентного излучения. Изображение сферулита инсулина, полученное после выполнения растрового сканирования 2ПФМ, соответствовало зарегистрированным на сферулит. Также было проверено положение полуволновой пластины, соответствующее возбуждению образца по осям X и Y.
Полярные графики изменились при выполнении полного поляризационного анализа из разных выбранных точек. За пределами сферулита граф PLO выглядел как набор артефактов и случайных всплесков шума сигнала. Правильно измеренные полиграфы из высокоупорядоченных мест по осям X и Y имели различную форму и геометрию в зависимости от локальной ориентации и организации флуорофоров.
