Для начала с помощью сверхмощных ножниц или ножниц отрежьте конец крышки на расстоянии 0,5 миллиметра от конического дна микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитров. Поместите кусочек стекловаты в отрезанную трубку, чтобы закрыть центральное отверстие. Поместите один собранный фильтрующий блок из стекловаты в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и наклейте на нее этикетку.
Затем разрежьте 96-луночный ПЦР-планшет без юбки на шесть двухколонных опорных штативов. Переверните двухколонные стойки так, чтобы конические днища лунок были обращены вверх. Поместите решетку в стеклянную чашку Петри, содержащую влажную фильтровальную бумагу, и накройте ее крышкой, чтобы создать камеру влажности для оболочек листьев.
Чтобы собрать конидии из спорулирующего Colletotrichum graminicola, добавьте в тарелку три-четыре миллилитра стерильной деионизированной воды. С помощью стерильного пестика с коническим коническим кончиком равномерно соскребите по всей пластине, чтобы удалить споры из агара. Асептически добавьте один миллилитр споровой суспензии на фильтрующий блок из стекловаты и позвольте спорам течь в коллекторную трубку под действием силы тяжести.
Отфильтрованную споровую суспензию центрифугируйте при температуре 3 500 г в течение пяти минут и слейте жидкость в автоклавируемую емкость. Добавьте один миллилитр стерильной деионизированной воды в пробирку для сбора и осторожно перемешайте, чтобы повторно суспендировать гранулированные споры. Снова центрифугируйте суспензию и повторно суспендируйте споры для количественного определения в 300-500 микролитрах деионизированной воды.
Используйте гемоцитометр под сложным микроскопом при 100-кратном увеличении, чтобы определить концентрацию спор. Затем приготовьте 500, 000 спор на миллилитр суспензии с деионизированной водой. Для удаления влагалища с первого настоящего листа недели двухэтапная рассада.
Проведите ногтем большого пальца по перекрывающемуся краю ножен и осторожно отсоедините его от желоба. Разрежьте восстановленную листовую влагалище на трех-пятисантиметровые сегменты. Осторожно разверните каждый сегмент, чтобы обнажить внутренний слой эпидермиса.
Нанесите 20 микролитров суспензии спор гриба на внутреннюю поверхность в центре влагалища над средним ребром. Поместите инокулированные влагалища листьев горизонтально, со средним ребром, расположенным внизу, в стеклянную пластину Петри, содержащую смоченную фильтровальную бумагу. Затем поместите небольшие камеры влажности в прозрачный ящик для хранения, застеленный влажной бумагой для проращивания, накройте ящик для хранения крышкой и инкубируйте при температуре 23 градуса Цельсия при непрерывном освещении в течение намеченного времени.
Регулярно проверяйте коробки на наличие признаков болезней на влагалищах.
