Для начала приготовьте органоидную питательную среду, содержащую 10 микромоляров Y-27632 и 2,5 микромоляра CHIR-99021. После нанесения покрытия ECM на кишку-на-чипе отсоедините выпускную трубку от верхнего микроканала, оставляя перепускную трубку верхнего микроканала открытой. С помощью зажима для скоросшивателя закрепите входное и выходное отверстия нижнего микроканала.
С помощью микропипетки Р100 добавьте 20 микролитров клеточной суспензии в выпускное отверстие верхнего микроканала. Закрепите байпас и впускную трубку верхнего микроканала с помощью зажимов для связующих. Прикрепите выпускную трубку к выпускному отверстию верхнего микроканала, убедившись, что трубка остается открытой на протяжении всего процесса.
После этого постепенно закрепите выпускную трубку верхнего микроканала с помощью зажима для связующего вещества. Далее под микроскопом убедитесь, что клетки равномерно распределены по всему верхнему микроканалу. Поместите устройство «кишка на чипе» и увлажненный инкубатор углекислого газа при температуре 37 градусов по Цельсию.
Подсоедините шприц, прикрепленный к верхнему микроканалу чипа, к шприцевому насосу, размещенному внутри инкубатора. Установите скорость потока 30 микролитров в час и запустите непрерывный поток рабочей среды для верхнего микроканала. В течение этого периода оставьте нижний микроканал зажатым.
На следующий день после посадки замените среду органоидной питательной средой, содержащей только А-83-01. После того, как монослой установлен для верхнего микроканала, инициируйте непрерывный поток питательной среды в нижний микроканал. Далее вводят органоидную питательную среду как в верхний, так и в нижний микроканалы, чтобы инициировать развитие трехмерного морфогенеза в чипе.
Увеличьте скорость потока до 50 микролитров в час, чтобы добиться абсолютного стресса в 0,02 обеда на квадратный сантиметр в конструкции «кишка на чипе». Используя биореактор, регулируемый компьютером, примените 10%-ную циклическую деформацию и частоту 0,15 герц к клеткам, культивируемым на устройстве «кишечник-на-чипе», в течение двух-трех дней, чтобы установить трехмерный морфогенез. Через шесть-девять дней среднего потока наблюдалась периодическая кластеризация трехмерного морфогенеза эпителиальных клеток кишечника собак по всему микроканалу.
Иммунофлуоресцентное окрашивание оценивало трехмерную структуру органоидных монослоев и ворсинчатых структур в микрофлюидных чипах. Барьерная функция кишечника, измеренная с помощью TEER, показала стабильные значения TEER на пятый день посева.
