Проточный цитометрический анализ митофагии в β-клетках поджелудочной железы мыши с использованием красителя MtPhagy

Приступайте к проточному цитометрическому анализу митофагии бета-клеток с получением суспензии одной клетки из около 100 изолированных зеркальных островков, соответствующих каждому желаемому экспериментальному условиям, подлежащим изучению. Во-первых, повторно суспендируйте образцы островков для каждого условия в 500 микролитрах среды для протекания островков. Добавьте 0,25 микролитра запаса MtPhagy в пробирки, предназначенные для приема красителя MtPhagy.

Аналогичным образом добавьте 0,25 микролитра материала TMRE и материала флуозин-3-AM в соответствующие предназначенные для этого пробирки. Оберните трубки алюминиевой фольгой и перемешивайте каждую трубку на низкой скорости в течение пяти секунд, чтобы перемешать содержимое. Затем инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

В середине инкубации переведите каждый образец на низкой скорости в течение 5-10 секунд. После инкубации центрифугируйте пробирки при 350 G в течение одной минуты при 10 градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость.

И ресуспендировать образцы в 500 микролитрах проточной среды островков. Добавляйте DAPI в микроцентрифужные пробирки, содержащие образцы, требующие обработки DAPI. Снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, как было показано ранее.

Суспендируйте остаток в 500 микролитрах проточной среды для островков. Наконец, поместите образцы на лед, а затем приступайте к проточной цитометрии. Отрегулируйте напряжения для прямого рассеяния или FSC и бокового рассеяния или SSC, чтобы убедиться, что популяции клеток находятся в центре диаграммы рассеяния.

Чтобы исключить кратность, в прямоугольном стробе по высоте FSC от ширины FSC, а затем по высоте SSC от ширины SSC. Отрегулируйте напряжение и компенсацию DAPI для фильтрации живых бета-элементов. Установите флуоресцентные затворы для каждого используемого флуорофора на основе неокрашенного образца RFD.

После установки гейтов соберите 10 000 событий для каждого образца. Бета-клетки с высокой утилизацией митофагии были определены как флуозиновая популяция с высоким уровнем MtPhagy и низкой TMRE в третьем квадранте или Q3. Базальные уровни и уровни валиномицин-индуцированной митофагии были охарактеризованы как на островках RFD, так и на HFD.