Для начала возьмите флакон, содержащий гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки костного мозга мыши. С помощью микропипетки повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре лизирующего буфера ACK и инкубируйте в течение одной-двух минут при комнатной температуре. Перелейте ресуспендированную смесь в 50-миллилитровую пробирку через предварительно смоченное сетчатое фильтр 70 микрометров.
Затем добавьте 10 миллилитров буфера FACS, чтобы разбавить лизирующий буфер ACK. Центрифугируйте смесь при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах буфера FACS, сначала восстановив ее в одном миллилитре буфера, а затем долив девять миллилитров буфера. Теперь смешайте 10 микролитров 0,4% трипанового синего с 10 микролитрами клеток в пробирке объемом 0,5 миллилитра и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
Чтобы окрашивать клетки, центрифугируйте их при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в буфере FACS для достижения конечной концентрации от 1 до 10 до семи клеток на миллилитр путем предварительной суспендирования гранулы в одном миллилитре буфера, а затем доливая оставшийся объем. С помощью микропипетки P1000 перенесите суспензию в пробирку FACS через колпачок сетчатого фильтра с диаметром 35 микрометров.
Далее приготовьте смесь для окрашивания, как показано здесь. После центрифугирования клеточную суспензию повторно суспендировать в 300 микролитрах красителя, смешать по одному в пробирке с образцом и инкубировать на льду в течение 15 минут в защищенном от света месте. Затем добавьте 300 микролитров смеси два раза в пробирку с образцом и выдерживайте 20 минут на защищенном от света льду.
Добавьте три миллилитра буфера FACS в пробирки с одним окрашенным и смешанно окрашенным образцом. Теперь центрифугируйте клеточную суспензию. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера FACS.
Приготовьте 1,5-миллилитровую пробирку, предварительно заполненную 500 микролитрами собирательной среды. После калибровки прибора FACS добавьте 500 микролитров буфера FACS в клеточную суспензию, а затем перенесите один миллилитр образца через крышку сетчатого фильтра с плотностью 35 микрометров в новую пробирку FACS. После сортировки клеток перенесите 10 микролитров отсортированных клеток в новую пробирку FACS, содержащую 90 микролитров буфера FACS.
Гранулированную клеточную суспензию методом центрифугирования и повторно суспендировать в 50 микролитрах PBS с 0,04% БСА. Перенесите суспензию в пробирку объемом 0,2 миллилитра и добавьте 50 микролитров PBS с BSA в исходную пробирку, чтобы собрать остатки клеток. Перенесите клетки в пробирку объемом 0,2 миллилитра, чтобы получить общий объем 100 микролитров.
Проведите пилотный эксперимент, чтобы определить наилучшее время лизиса для выделения ядер. После гранулирования ядер ресуспендируйте ядра в 12 микролитрах разбавленного ядерного буфера. Добавьте два микролитра ядер в пробирку, содержащую 0,4% трипанового синего и восемь микролитров PBS с 0,04% BSA, и подсчитайте ядра с помощью автоматического счетчика клеток.
После завершения выделения ядер перенесите шесть микролитров ресуспензии ядер в новую пробирку FACS, предварительно заполненную 150 микролитрами буфера FACS. Добавьте три микролитра 7-AAD и выдержите пять минут на льду.
