Для начала трансфектируйте клетки аденокарциномы желудка TMEM200A Si-РНК и инкубируйте в течение двух дней. Затем выбросьте среду для культивирования клеток из лунок и аккуратно промойте клетки два раза одним миллилитром PBS. Поместите клетки на лед и добавьте 150 микролитров предварительно охлажденного буфера для лизиса радиоиммунного преципитации.
С помощью пластикового скребка аккуратно отделите прилипшие клетки от чашки и аккуратно переложите клеточный раствор в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку. Затем центрифугируйте лизат клеток в соотношении 1,5 на 10, поднятый до степени 4 G, в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, и перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Используя набор для анализа белка BCA, определите содержание белка, следуя инструкциям производителя.
Загрузите по 30 граммов белка из каждого образца в 10% гель SDS-PAGE. Запустите гель при напряжении 80 вольт в течение 0,5 часов, а затем 1,5 часа при напряжении 120 вольт. Затем перенесите белки из геля на 45-микрометровую мембрану из PVDF с постоянным током 300 миллиампер в течение 1-1,5 часов.
Поместите мембрану из ПВДФ на шейкер на три цикла по пять минут каждый. После встряхивания добавьте TBST в контейнер белковой стороной вверх. Поместите мембрану в блокирующий буфер на 30 минут при комнатной температуре.
Промойте мембрану с TBST в течение трех циклов по 10 минут каждый. Инкубируйте мембрану с первичными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После трехкратного промывания мембраны с TBST добавьте вторичное антитело кролика или мыши и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем добавьте подложку ECL на мембрану PVDF на 30 секунд и обнаружьте сигнал с помощью системы визуализации. Эффективность TMEM200A была значительно снижена в клетках рака желудка HGC-27, трансфицированных Si-РНК, по сравнению с нетрансфицированными клетками. Si-РНК TMEM200A значительно ингибировала родственные белки в эпителиальном мезенхимальном переходе и влияла на фосфорилирование AKT в сигнальном пути фосфоинозитида 3-киназы.
