Подготовка планшета для флуоресцентной визуализации и оценки жизнеспособности клеток в кокультуре CAR-Jurkat с опухолевыми клетками, меченными CFSE

После совместного культивирования юркатов, экспрессирующих CAR, с опухолевыми клетками, меченными CFSE, аккуратно переверните планшет на бумажном полотенце и постукивайте постом, чтобы удалить надосадочную жидкость, содержащую CAR-J. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 микролитров среды FluoroBrite DMEM, содержащей пропидий-йод, или PI, в лунки, не нарушая прилипшие опухолевые клетки. Затем добавьте 20 микролитров 20% Triton X в первую лунку каждого типа опухоли, служащей в качестве полного мертвого контроля.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 20 минут перед визуализацией. После флуоресцентной визуализации используйте одну из лунок клеток, предназначенных только для опухоли, чтобы откалибровать зеленый флуоресцентный канал. Чтобы исключить клетки на краю лунок, уменьшите маску лунки до 98%Определите меченые CFSE опухолевые клетки на зеленом флуоресцентном канале и отрегулируйте пороговое значение интенсивности флуоресценции, чтобы захватить все клетки в лунке.

Установите минимальный диаметр ячейки на 25 микрометров, чтобы исключить мусор, обнаруженный в канале CFSE. Затем включите отдельные соприкасающиеся объекты для идентификации отдельных клеток. Далее установите вентили для определения популяций живых и мертвых клеток.

Выберите ячейки, помеченные CFSE, и сгенерируйте гистограмму количества чисел по оси y в зависимости от средней интенсивности PI по оси x. Отрегулируйте значение по оси x, чтобы лучше визуализировать клетки, и нарисуйте разделитель, чтобы различать клетки с низким и высоким PI. Пометьте клетки, окрашенные с низким PI, как живые.

Далее устанавливаем еще одну гистограмму на живых ячейках с площадью по оси x и счетами по оси y. Пометьте клетки, не содержащие остатков, как большие живые клетки. Затем нарисуйте еще один разделитель, используя опухоль только для захвата клеток и фильтрации мусора.

После выполнения анализа на всей пластине экспортируйте таблицу, содержащую числа. Построить график подсчета больших клеток, чтобы определить количество живых меченых CFSE опухолевых клеток, оставшихся в лунке после воздействия CAR-J. Наконец, выполните статистический анализ с помощью односторонней ANOVA.

Цитотоксичность CAR-J1 увеличивалась с более высоким соотношением эффектора к опухоли, и более 50% убийства наблюдалось при соотношении эффектора к опухоли четыре к одному. Нацеленные на EGFR конструкции CAR с модифицированными шарнирными доменами показали антиген-специфическое убийство против клеток EGFR, экспрессирующих MDA-MB-231, и не наблюдалось значительного уничтожения против нокаутных клеток EGFR. Конструкции CAR также экспрессировались на CD3 Т-клетках, полученных из PBMC.

Тем не менее, не было выражено CD8, содержащего шарнир EGFR-CAR. Короткий IgG показал наименьшую цитотоксическую активность в отношении клеток MDA-MB-231 по сравнению со средой IgG long и IgG.