Для начала удалите спинной мозг обезглавленной мыши, которая была пробита PBS. Погрузите спинной мозг в холодный DPBS в чашку Петри на льду. С помощью иглы 18-го калибра и 10-миллилитрового шприца, наполненного холодной DPBS, используйте гидравлическую экструзию, чтобы изолировать весь спинной мозг в капюшоне с ламинарным потоком.
Перенесите спинной мозг в чашку Петри с холодным DPBS, помещенным на пакеты со льдом. С помощью микроскопа внутри колпака ламинарного потока осторожно удалите все видимые мозговые оболочки острыми щипцами. Затем перенесите спинной мозг в пустую чашку Петри и с помощью лезвия хирургического скальпеля No 10 разрежьте его на участки длиной от двух до трех миллиметров.
Для ферментативной диссоциации клеток спинного мозга добавьте смеси ферментов 1 и 2 к кусочкам спинного мозга. Перемешайте ферменты в чашке несколько раз, чтобы обеспечить равномерное покрытие спинного мозга. Выдержите блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, вручную переворачивая блюдо каждые 10 минут.
После инкубации добавьте 350 микролитров ДНКазы I. Аккуратно перемешайте блюдо. Затем добавьте один миллилитр холодного DMEM с добавлением 0,5% FBS перед аккуратным перемешиванием. Сразу же переложите все содержимое в пятимиллилитровую трубку.
С помощью пипетки P1000 аккуратно разотрите ткань три раза. Затем с помощью закупоренной девятидюймовой стеклянной пипетки Пастера аккуратно растирайте ткань еще пять раз. Поместите трубку вертикально на 30 секунд, чтобы ткань осела.
С помощью пипетки P1000 отсадите надосадочную жидкость и пропустите ее через 30-микрометровый фильтр в 15-миллилитровую коническую трубку. К тюбику с оставшимися тканями добавьте один миллилитр ДМЭМ, дополненного FBS. Затем аккуратно разотрите три раза с помощью пастеровской пипетки.
Дав ткани осесть на дне, пропустите надосадочную жидкость через 30-микрометровый фильтр и соберите ее в ту же 15-миллилитровую трубку, которая использовалась ранее. Отфильтрованную клеточную суспензию центрифугировать при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. С помощью вакуумного аспиратора осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
Используйте раствор для удаления мусора, входящий в набор для диссоциации мозга у взрослых, чтобы удалить миелин из клеточной гранулы. Затем добавьте в гранулу пять миллилитров DMEM, обогащенного FBS, и осторожно переверните трубку три раза, чтобы перемешать. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре DPBS, дополненного FBS.
Еще раз центрифугируйте перед тем, как выбросить надосадочную жидкость. Маркировал клетки микрогранулами Anti-ACSA-2 в соответствии с протоколом производителя. Используйте столбцы магнитного разделения для разделения ячеек путем положительного выбора.
Затем центрифугируйте клетки при 300 г в течение 10 минут, прежде чем отбросить надосадочную жидкость. Далее ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре теплого DMEM, дополненного FBS. Перенесите клеточную суспензию на гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность.
Отрегулируйте концентрацию клеток до 75 000 клеток на 50 микролитров с помощью FBS DMEM. Затем перенесите 50 микролитров клеточной суспензии в покровное стекло, покрытое поли-л-лизином, в 24-луночном планшете. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы клетки могли прилипнуть к покровному стеклу.
Затем осторожно добавьте в каждую лунку по 450 микролитров теплого FBS DMEM с добавлением антибиотиков. Наблюдалось успешное выделение и пролиферация микроглии и астроцитов. К четвертому дню было замечено, что астроциты образуют более длинные отростки, в то время как были замечены овальные микроглиальные клетки с более короткими веретенами.
К седьмому дню астроциты сформировали связанный сливающийся слой, при этом микроглия демонстрировала все меньше и короче процессы. Сортировка клеток подтвердила жизнеспособность выделенной клеточной культуры на 92-93%.
