Для начала извлеките только что вырезанный сальник человека из контейнера для сбора внутри ламинарного колпака. Погрузите сальник в PBS, чтобы аккуратно смыть остатки крови или мусора. С помощью скальпеля и щипцов разрежьте ткань на кусочки.
Поместите кусочки сальника в отдельные лунки 24-луночного культурального планшета. Затем заполняют лунки 500 микролитрами питательной среды сальника. Добавьте 10 миллилитров стерильного PBS в колбу для культивирования, содержащую 75% сливающихся человеческих клеток mCherry-положительного рака яичников.
Аккуратно покачайте колбу, чтобы промыть клетки. Удалите PBS и добавьте три миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА. Осторожно покачайте колбу для культивирования еще раз, чтобы равномерно распределить трипсин ЭДТА на прикрепленных клетках.
Затем поместите колбу в инкубатор на пять минут при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа. После этого достаньте колбу из инкубатора. Теперь постучите по колбе с культурой, чтобы полностью отсоединить клетки.
Затем добавьте три миллилитра питательной среды сальника, чтобы нейтрализовать трипсин. Пропипетируйте клеточную суспензию несколько раз, чтобы она хорошо перемешалась. Переложите суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте суспензию при 1,200 G в течение пяти минут при температуре 24 градуса Цельсия. Теперь пипеткой выдавите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в шести миллилитрах свежей питательной среды сальника. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии, чтобы подсчитать клетки с помощью счетчика клеток.
Разбавляют клеточную суспензию свежей питательной средой до необходимой плотности. С помощью шприца объемом один миллилитр наберите суспензию раковых клеток. Прикрепите к шприцу иглу 26 калибра.
Теперь с помощью небольших хирургических щипцов возьмите кусочек разрезанного сальника и поместите его в отдельную рабочую стерильную посуду. Затем вводят в ткань около 100 микролитров суспензии раковых клеток. В качестве альтернативы смешивают равные объемы размороженного матрицы базальной мембраны с культурой сальника.
Выложите смесь на лед до инъекции. После погружения кусочков сальника в матричную смесь в лунки культуральной планшета инкубируют планшет в течение 20 минут. После этого извлеките пластину из инкубатора.
Как только смесь застынет, введите кусочки сальника вместе с раковыми клетками. Подтвердите успешную инъекцию раковых клеток с помощью флуоресцентной визуализации. В качестве подтверждения в местах инъекции можно увидеть полосу флуоресцентного сигнала.
Чтобы облегчить совместное культивирование сальника и раковых клеток, добавляйте от 500 до 200 микролитров свежей среды каждые 48-72 часа. Наконец, с помощью флуоресцентного микроскопа следите за ростом опухолей рака яичников. Рост опухоли может быть заметен через две недели.
Клетки рака яичников были успешно интегрированы в кусочки сальника к 14-му дню. Раковые клетки первоначально распространяются по поверхности сальника в первую неделю. Со временем клетки конгрегировались, образуя опухоли.
Опухолевая нагрузка подтверждалась изменением цвета сальника, который менял цвет со красного на желтый.
