Для начала наполните каждую иглу пятью микролитрами раствора GFP nanobody с меткой Alexa Fluor. Поместите покровный стеклопакет размером 25 на 25 мм на поверхность предметного стекла. Нанесите пипеткой 40 микролитров галогеноуглеродного масла на предметное стекло и распределите его по периметру покровного стекла.
Под инъекционным микроскопом приложите кончик иглы к краю покровного стекла, погруженному в масло. Соответствующим образом отрегулируйте давление воздуха для впрыска PicoPump. Замените пустое предметное стекло на подготовленное предметное стекло с эмбрионом дрозофилы.
Установите кончик инъекционной иглы перпендикулярно передне-задней оси эмбриона. Используйте манипулятор XY-стадии, чтобы направлять эмбрионы к игле до тех пор, пока кончик не достигнет центра желтка, и накачайте два-три раза, чтобы влить антитела в желток. С помощью манипулятора XY-ступени можно отвести эмбрионы от иглы после инъекции и переместить их к следующему эмбриону.
Дайте эмбрионам инкубироваться при температуре 25 градусов Цельсия до достижения желаемой стадии развития. После инкубации идентифицируют эмбрионы под маломощной линзой с ярким освещением поля и переключаются на линзу 40X или 63X для флуоресцентной визуализации в реальном времени с высоким разрешением. После инъекции отношение сигнал/шум Notch-рецептора значительно улучшается по сравнению с качеством сигнала иммунофлуоресценции.
Кроме того, инъекция антител позволила охарактеризовать временную локализацию надреза с 45-секундными интервалами без видимой потери интенсивности сигнала в течение пятиминутного окна визуализации. Визуализация эмбрионального фосфотирозина в реальном времени показала, что фосфорилирование тирозина сильно обогащено в трехклеточных соединениях. Кроме того, новая вторая популяция сигнала фосфотирозина наблюдалась под центром апикальной мембраны.
Двухцветная визуализация показала, что эта популяция сигнала фосфотирозина находится вблизи медиального миозина. Кроме того, медиальная популяция фосфотирозина демонстрировала аналогичные пульсирующие картины коалесценции и диссипации, как показано для медиального миозина.
