Выделение и диссоциация кишечника из личинок данио-рерио для обогащения кишечных клеток методом FACS

Для начала приготовьте 1,8%-ную агарозную пластину со средой HEPES Buffered E3 или E3. Во время работы под диссекционным микроскопом поместите на агарозную пластину от шести до 10 личинок под наркозом. Положите по одной булавке от насекомых на голову каждой личинки. Затем удалите остатки Е3 с пластины с помощью салфетки.

С помощью еще одной булавки от насекомых изолируйте кишечник от личинок, не потревожив никакие другие органы. Обеспечьте правильное удаление желтка. После выделения осмотрите кишечник и удалите все некишечные материалы, такие как кожа, жир или печень.

С помощью пинцета соберите кишечник и перенесите его в PBS, содержащий 10% FCS, в микроцентрифужную пробирку, помещенную на лед. Сразу после вскрытия всех кишечников центрифугируйте микроцентрифужную пробирку при давлении 13 800 г в течение 30 секунд. Удалите надосадочную жидкость, оставив в трубке около 100 микролитров, чтобы не допустить пересыхания кишечника.

Добавьте 500 микролитров раствора папаина в кишечник в зонд. Активируйте папаин, добавив 2,5 микролитра одного моляра цистеина. Затем инкубируйте трубку, содержащую кишечник, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Через пять минут пипеткой выводите содержимое вверх и вниз наполовину, чтобы стимулировать ферментативное переваривание тканей. Перенесите диссоциированные клетки в пробирку для сортировки клеток, активируемую флуоресценцией, или FACS, через предварительно подключенный клеточный фильтр толщиной 35 микрон. Промойте ситечко несколько раз, добавив 0,5 миллилитра PBS, содержащего 10% FCS, к общему объему стирки в два миллилитра.

Центрифугируйте собранный фильтрат при 700 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия, и удалите надосадочную жидкость. Добавьте один микрограмм на миллилитр DAPI к 300 микролитрам PBS, содержащим 10% FCS. Добавьте эту смесь в гранулу и повторно суспензируйте для маркировки мертвых клеток.

Затем инкубируйте в течение пяти минут на льду, чтобы обеспечить их исключение во время последующего анализа FACS.