Забор и выделение костного мозга мышей для характеристики микроокружения миелоидного лейкоза

Для начала удалите ткань из костей усыпленной вскрытой мыши. Поместите очищенные кости в новую шестилуночную пластину с буфером FACS, помещенную на лед. Переложите кости в ступку с двумя-пятью миллилитрами буфера FACS.

Измельчите кости круговыми движениями до тех пор, пока костный мозг не освободится. С помощью трехмиллилитрового шприца потяните вверх и промойте костный мозг, чтобы гомогенизировать его. Вытащите гомогенат в другой шприц, затем отфильтруйте его через клеточное сетчатое фильтр 70 микрометров в 50-миллилитровую пробирку.

Промойте кусочки ткани от фильтра обратно в раствор с помощью буфера FACS перед второй гомогенизацией. Процедите промытую салфетку, как и раньше. Затем промойте оставшиеся костные спикулы обратно в раствор с помощью буфера FACS.

Затем промойте кусочки в 15-миллилитровую трубку, чтобы обеспечить максимальный выход. Чтобы переварить костный мозг, сначала центрифугируйте его при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулы костного мозга в двух миллилитрах смеси для пищеварения.

Переложите смесь в тубу объемом 15 миллилитров. Затем инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут на ротаторе. Теперь добавьте 10 миллилитров буфера FACS, чтобы остановить ферментативное переваривание.

Отфильтруйте смесь через клеточное сетчатое фильтр 70 микрометров в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте суспензию при 400 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов.

Затем добавьте 10 миллилитров буфера FACS, чтобы остановить лизис. Затем процедите смесь, как и раньше, в 50 миллилитровую трубку. Наконец, центрифугируйте смесь при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах буфера FACS. Для переваривания костных спикул, в первую очередь, делают вихревые костные спикулы. Сцедите надосадочную жидкость и оставьте кости на дне.

Далее ресуспендируйте спикулы в одном миллилитре костной смеси для переваривания спикул. Инкубируйте трубку на ротаторе в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, остановите разложение с помощью 10 миллилитров буфера FACS.

Отфильтруйте смесь в 50-миллилитровую пробирку, содержащую лизированный и переваренный эритроцит костного мозга.