Для начала с помощью щипцов удалите любой жир и соединительную ткань из рассеченной подчелюстной слюнной железы усыпленной мыши. Затем поместите железу в сборную трубку с ледяным раствором HBSS. Далее с помощью щипцов разрежьте железу на квадратные кусочки по одному сантиметру.
Нагрейте 4%-ную агарозу до 50 градусов Цельсия, и перелейте раствор в 35-миллиметровую посуду. Налейте небольшое количество раствора агарозы в отдельную посуду и добавьте в нее кусочки железы. Затем обваляйте кусочки в излишках агарозы, чтобы покрыть ее.
Далее выложите четыре-шесть кусочков железы плоской в первую посуду с агарозой. Накройте блюдо крышкой и переложите его в холодильник, накрыв тарелку льдом, чтобы он остыл и застыл. Чтобы разрезать кусочки железы, сначала с помощью скальпеля аккуратно разрежьте вокруг железы встроенный агарозный блок.
Далее нанесите каплю суперклея на агарозный блок и приложите его к стадии вибратома. Теперь заполните вибратомную камеру ледяным PBS, содержащим 1% пенициллина стрептомицина. С помощью скальпеля срежьте излишки агарозы и создайте пятимиллиметровые зазоры между каждым кусочком железы.
Совместите вибратомное лезвие с агарозным блоком и установите начальную и конечную точки секций. Разрежьте тканевый блок на участки толщиной 150 микрометров с низкой скоростью и высокой вибрацией. После того, как срезы будут вырезаны, возьмите их кистью и положите их в чашку с предварительно подогретым фильтром RPMI, содержащим антибиотики.
Чтобы культивировать подчелюстные срезы, сначала добавьте 1,5 миллилитра среды RPMI в лунки шестилуночного планшета. Поместите в лунки фильтры 0,4 микрометра. Далее с помощью кисти аккуратно перенесите от одного до шести ломтиков на каждый фильтр.
Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислым газом. Облучив некоторые экспериментальные пластины гамма-излучением для индуцирования травмы, верните пластины в инкубатор. Далее заполните лунки 24-луночной пластины 500 микролитрами питательной среды.
С помощью кисточки снимите срезы с фильтра и аккуратно погрузите их в лунки. Инкубируйте срезы в соответствующих ядерных пятнах. Затем инкубируйте ломтики с антителами в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании.
Погрузите срезы в питательные среды три раза, чтобы промыть их. Дайте ломтикам поинкубироваться в каждом моющем растворе в течение 10 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании. Затем с помощью щипцов снимите ленту с двустороннего спейсера для визуализации.
Приклейте распорку к дну шестилуночной пластины со стеклянным дном, затем нанесите пипеткой 50 микролитров среды в зазор в центре распорки. Поместите ломтик в среду, убедившись, что он лежит ровно. Затем с помощью пипетки аккуратно удалите 20 микролитров среды из зазора.
С помощью щипцов осторожно снимите ленту с верхней стороны распорки и наденьте на нее 25-миллиметровую круглую крышку. Прижмите края распорки, чтобы обеспечить надежное крепление чехла. Визуализируйте срез на конфокальном микроскопе.
Необлученные срезы подчелюстной железы, культивируемые в течение семи дней, сохраняли сигнал МТ и эпителиальную архитектуру. Однако через три дня после облучения наблюдалась ацинарная и протоковая клеточная атрофия. Каспазоположительные клетки были обнаружены через четыре дня после облучения.
В облученных срезах наблюдался повышенный уровень гамма H2AX, что свидетельствует о повреждении ДНК in vivo. Визуализация макрофагов в реальном времени подтвердила фагоцитоз эпителиальных клеток в модели культуры среза. Отдельные клетки могут быть обнаружены и сегментированы для последующего анализа клеточного поведения, такого как миграция.
