Для начала поместите 25-миллиметровую стеклянную крышку в лунки шестилуночного клеточного планшета. Поместите каплю полилизина в центр каждой крышки. После завершения инкубации промойте каждый покровный листок три раза дистиллированной водой.
Затем дважды промойте чехол солевым раствором, не содержащим кальция. Далее установите крышки в записывающую камеру и заполните ее физиологическим раствором, не содержащим кальция. Соберите блуждающих личинок третьего возраста от нужного генетического скрещивания дрозофилы.
Хорошо переложите личинок в посуду, после чего трижды промойте личинок дистиллированной водой. Поместите личинок в другую стеклянную чашку для вскрытия, содержащую 750 микролитров ледяного солевого раствора без кальция. Теперь поместите личинки под стереомикроскоп.
С помощью пары щипцов сделайте поперечный разрез поперек задней части живота. Надавите щипцами на челюсть, чтобы вывернуть личинки наизнанку. Осмотрите вентральный нервный канатик рядом с челюстью.
Аккуратно удалите имагинальные диски и оставшиеся ткани мозга. Далее отделите вентральный нервный канатик с центральным мозгом и зрительными долями от остальной ткани. Перенесите вентральный нервный канатик в записывающую камеру, содержащую физиологический раствор, не содержащий кальция.
Чтобы избежать помех, приложите оставшиеся нервы к нижней части чехлового листика щипцами. Чтобы провести эксперименты над жировыми телами, приступайте к выделению жировых тканей из вывернутой личинки. Поместите изолированные жировые тела, выражающие датчики ладов, в камеру записи.
Чтобы получить изображения тканей, выражающих сенсоры, включите систему подсветки микроскопа. Поместите записывающую камеру, содержащую вентральные нервные канатики или жировые тела, на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Чтобы просмотреть флуоресценцию GCaMP6f, установите длину волны возбуждения равной 488 нанометрам.
Для таких метаболитов, как лаконические, пироновые, АТФ или глюкозные сенсоры, установите возбуждение на 440 нанометров. Теперь установите получение изображения через равные промежутки времени для GCaMP6f и датчика метаболита. Установите объектив для погружения в воду так, чтобы он оставался погруженным в воду.
Далее подключите записывающую камеру к перфузионной системе. Используйте перистальтический насос с низким потоком для извлечения жидкости из камеры и поддерживайте постоянный поток на уровне трех миллилитров в минуту. Расположите раствор, содержащий пробирки, на расстоянии 25 сантиметров над предметным столиком микроскопа.
Перед любой стимуляцией получите стабильный базовый уровень флуоресценции, позволив записывающему раствору течь в течение 5-10 минут. Теперь замените проточный раствор раствором для стимуляции, содержащим глюкозу, пируват или лактат, на пять минут. Сделайте снимки стимулированного вентрального нервного канатика, который подвергся воздействию 80 микромольного пикротоксина, для оценки активности нейронов.
Лаконичные сенсоры как в глиальных клетках, так и в моторных нейронах реагируют на один миллимолярный лактат с одинаковой скоростью в начале импульса. Тем не менее, моторные нейроны достигают более высокого увеличения по сравнению с исходным уровнем в течение пятиминутного импульса. Сигнал датчика глюкозы увеличивался с одинаковой скоростью в глиальных клетках и нейронах при воздействии пяти миллимолярных глюкоз.
Однако во время импульса глюкозы сигнал в нейронах увеличивается больше, чем в глиальных клетках. Нокаут транспортера Часки снижает транспорт лактата в глиальных клетках. Индуцированное пикротоксином увеличение активности нейронов привело к временному падению уровня АТФ в соме моторных нейронов.
Было замечено, что лаконичный сенсор хорошо выражен у полных тел. Повышенная флуоресценция рецепторов глюкозы наблюдалась, когда жировые тела подвергались воздействию возрастающей концентрации глюкозы. Повышение концентраций лактата и пирувата приводило к пропорциональному увеличению лаконической и пиронической флуоресценции.
