Перед прохождением клеток. Покройте шестилуночный планшет холодным раствором для покрытия и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным углекислым газом в течение одного часа, аспирируйте среду стволовых клеток из шестилуночной пластины, содержащую плюрипотентные стволовые клетки человека, и добавьте один миллилитр DPBS, не содержащего кальция и магния, в каждую лунку. После второй промывки добавьте в каждую лунку по 500 микролитров раствора диссоциации и выдержите от двух до пяти минут при комнатной температуре.
Тем временем аспирируйте раствор для покрытия из шестилуночной пластины и добавьте один миллилитр DPBS, не содержащего кальция и магния, в каждую лунку. Под перевернутым микроскопом наблюдают за процессом диссоциации клеток. Когда от 80 до 90% клеток окажутся округлыми и адгезивными, отсасывайте раствор диссоциации из лунок шестилуночной пластины.
Затем добавьте один миллилитр среды стволовых клеток, содержащей 10 микромолярных ингибиторов породы, в шестилуночную пластину. Добавьте в пробирку 10 микролитров диссоциированной клеточной суспензии. Затем добавьте равный объем трипановой сини.
Аккуратно перемешайте и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. После подсчета клеток добавляют 2 миллилитра среды стволовых клеток на лунку, содержащую от 0,8 до 1 умножить на 10, до 6-х клеток на миллилитр и 10 микромолярных ингибиторов породы. Быстро перемещайте пластину вперед и назад, из стороны в сторону, три раза.
Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. Быстро переместите тарелку вперед-назад и из стороны в сторону 10 раз, прежде чем инкубировать в течение двух часов. Размораживают как базальную среду в течение нулевого, так и четвертого дня и добавки на льду.
Нагревайте два миллилитра каждый день на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Далее аспирируют среду стволовых клеток из лунок шестилуночной пластины и добавляют два миллилитра промывочной среды. После аспирации средства для промывки один немедленно добавьте два миллилитра средства первого дня к стенке лунки.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным содержанием углекислого газа в течение 24 часов. На 12-й день процесса дифференциации обработайте шестилуночную пластину, содержащую 400-микрометровые микролунки, двумя миллилитрами раствора для промывки против адгезии. Под перевернутым микроскопом понаблюдайте за пластиной на предмет пузырьков.
Если пузырьков не наблюдается, аспирируйте раствор для полоскания Anti-Adherence и сразу же добавьте два миллилитра моющего средства два. Затем аспират панкреатической среды-предшественника и добавляют 0,5 миллилитра диссоциационного буфера на лунку. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение двух-пяти минут.
Когда большая часть клеток округлится и все еще склеивается, отсасывайте диссоциационный буфер и сразу же добавляйте по одному миллилитру теплой кластерной среды в каждую лунку. Используя наконечник пипетки P1000, осторожно диссоциируйте клетки, пипетируя вверх и вниз, попеременно используя круговые движения и двигаясь сверху вниз лунки, чтобы равномерно отделить клетки по всей лунке. Перелейте диссоциированную клеточную смесь в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Добавьте один миллилитр кластерной среды в шестилуночную пластину, чтобы собрать все оставшиеся клетки. Затем отсасывают промывочную среду два из шестилуночной пластины микролунки и добавляют диссоциированную клеточную суспензию. Инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.
На следующий день, используя наконечник пипетки P1000, медленно собирайте кластеры из шестилуночного планшета в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте один миллилитр средства на 13-й день, чтобы собрать оставшиеся грозди и перенести кластеры в пробирку. Дайте клеткам естественным образом застыть на дне пробирки под действием силы тяжести в течение пяти минут.
Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость из пробирки, не нарушая клеточные кластеры. Затем добавьте в пробирку два миллилитра средства на 13 день. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, избегая аспирации кластеров.
Перенесите суспензию на шестилуночную пластину с очень низкой адгезией. Быстро перемещайте пластину вперед и назад, из стороны в сторону, шесть раз. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов.
Иммунофлуоресцентные изображения кластеров показали преобладание инсулин-продуцирующих клеток, экспрессирующих маркеры бета-клеток поджелудочной железы. Экспрессия генов сигнатуры бета-клеток выявила примерно 25% клеток, экспрессирующих Nkx6.1 и 40% экспрессирующих Pdx1. Во время анализа секреции инсулина, стимулированного глюкозой, кластеры, полученные из MEL1, секретировали значительно более высокие уровни инсулина в ответ на высокие концентрации глюкозы по сравнению с низкими концентрациями глюкозы.
