Для начала выберите 24-луночный планшет, содержащий вставки с фильтрами 0,4 микрона. С помощью пипетки добавьте 500 микролитров HBSS ниже и выше фильтрующих вставок. Затем закройте многолуночную пластину и поместите ее в инкубатор на два часа.
После инкубации осторожно отсасывайте HBSS из тарелки. Приготовьте бесклеточный раствор коллагена в стерильной 50-миллилитровой тубе в DMEM на льду. Добавьте 250 микролитров коллагена над мембранным фильтром и накройте пластину крышкой.
Дайте раствору полимеризоваться при комнатной температуре. Далее извлеките из инкубатора культуру клеток фибробластов L-929. Добавьте в колбу два миллилитра предварительно подогретого раствора трипсина ЭДТА и поместите в инкубатор на три-пять минут.
Переложите клеточную суспензию в стерильную 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте при 645 G в течение пяти минут. С помощью вакуумного насоса аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в одном миллилитре ДМЭМ. Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии в пробирку, содержащую 20 микролитров раствора Трипана Блю.
И используйте камеру для подсчета клеток для оценки плотности клеток. Далее извлеките из инкубатора культуру моноцитарных клеток U-937. Центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре RPMI.
Убедившись, что клетки находятся в однородном взвешенном состоянии, подсчитайте их с помощью камеры для подсчета клеток. Далее готовят клеточные суспензии, содержащие 50 000 L-929 и 15 000 U-937 клеток соответственно в 50 микролитрах DMEM. Добавьте в каждую 50 микролитров клеточной суспензии к 450 микролитрам коллагена и тщательно перемешайте.
Наложите на предварительно закодированную собственную бесклеточную пластинку с 500 микролитрами раствора коллагеновых клеток. Закройте пластину и поместите ее в инкубатор на два часа, чтобы раствор застыл. Далее извлеките культуру клеток Caco-2 из инкубатора.
С помощью вакуумного насоса отсадите среду и промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Добавьте пять миллилитров раствора трипсина ЭДТА PBS и поместите его в инкубатор на пять-восемь минут. Затем центрифугируют клеточную суспензию и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре DMEM.
После подсчета приготовьте клеточную суспензию, содержащую 150 000 клеток Caco-2 в 50 микролитрах DMEM. Поместите пластину в колпак с ламинарным потоком на 10 минут, прежде чем перенести ее в инкубатор. Через 30 минут добавьте 500 микролитров DMEM над реконструированной моделью и 500 микролитров ниже фильтра и верните тарелку в инкубатор.
На следующий день аккуратно замените среду на 500 микролитров свежего DMEM выше и ниже фильтра соответственно.
