Для начала разморозьте изолированные образцы плазмы крови при температуре 37 градусов Цельсия. Перелейте по 100 микролитров каждого образца плазмы в пробирки объемом 1,5 миллилитра. Добавьте по одному миллилитру буфера HBSA, не содержащего кальция, в каждую пробирку.
Центрифугируйте образцы при 20 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость до 20 микролитров, не нарушая гранулы. Затем добавьте по одному миллилитру буфера HBSA, не содержащего кальция, в каждую пробирку.
Затем пипеткой вверх и вниз, чтобы восстановить гранулу. Сделайте вихревыми движениями каждую трубку на несколько секунд, чтобы обеспечить равномерное распределение внеклеточных пузырьков. Затем центрифугируйте при 20 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Снова отсасывайте надосадочную жидкость до 20 микролитров, не нарушая гранулы. Затем восстановите гранулу в 80 микролитрах буфера HBSA, не содержащего кальция. Пипеткой двигайте суспензию вверх и вниз, чтобы получить равномерную суспензию.
Чтобы измерить активность фактора ткани внеклеточных везикул, сначала пипеткой введут 40 микролитров образца внеклеточного везикулы в две лунки 96-луночного планшета. В первую лунку добавьте 11 микролитров ингибирующего мышиного античеловеческого TF IgG. В другую лунку добавьте 11 микролитров контрольного мышиного IgG.
После инкубации добавьте в каждую лунку по 50 микролитров раствора факторной смеси. Накройте тарелку пленкой, затем выдержите тарелку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте 25 микролитров буфера HBSA EDTA, чтобы остановить выработку фактора Xa.
Восстановите хромогенный субстрат в дистиллированной воде до концентрации четырех миллимолей. Теперь добавьте в каждую лунку по 25 микролитров хромогенного субстрата. Накройте тарелку пленкой, а затем оберните ее алюминиевой фольгой.
Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем центрифугируйте планшет при 1,500 г в течение одной минуты, чтобы удалить любые пузырьки. Затем поместите пластину в считыватель пластин с температурой 405 нанометров.
Используйте стандартную кривую, полученную с помощью релипидированного рекомбинантного тканевого фактора, для преобразования генерации фактора Xa для каждой скважины. Затем рассчитайте генерацию фактора Xa, зависящего от тканевого фактора. Шесть из 11 доноров были ответившими на липополисахариды со средним и высоким уровнем липополисахарида, в то время как пять из 11 доноров были с низким уровнем липополисахаридов.
