Для начала подготовьте мышей под наркозом к хирургическому вмешательству. Хирургическими ножницами надрежьте кожу по центру выбритого участка головы, чтобы обнажить череп. Затем очистите череп стерильным ватным тампоном с использованием разбавленной перекиси водорода в течение одной-трех секунд и высушите череп новым стерильным ватным тампоном.
Чтобы выровнять череп спереди и сзади, измерьте дорсальную вентральную глубину на брегме и лямбде. Используя bgma в качестве отправной точки, найдите и отметьте нужную область на коре головного мозга. Затем используйте трепанное сверло и стоматологическую бормашину, чтобы обнажить кору головного мозга.
Убедитесь, что угол сверла перпендикулярен кривизне черепа, чтобы добиться равномерной трепанации черепа и предотвратить повреждение. Сверлите до тех пор, пока не почувствуете снижение сопротивления, а затем остановите процесс сверления. Кончиком иглы 23 калибра аккуратно удалите отслоившийся фрагмент кости.
Теперь очистите обнаженную кору хирургической пеной, смоченной в холодном ACSF, чтобы удалить любой мусор и остановить кровотечение. Сделайте разрез, чтобы облегчить введение микропризмы и уменьшить давление в коре головного мозга. Прикрепите хирургический нож к держателю на стереотаксическом плече и ориентируйте лезвие или стереотаксический рычаг так, чтобы резать вдоль медиальной латеральной оси.
Теперь переместите нож в нужную переднюю заднюю координату. Затем переместите нож к медиальному краю трепанации черепа и медленно опустите его, пока он не коснется кости. Используйте приведенное уравнение, чтобы определить глубину предварительно вырезанного разреза от поверхности черепа.
Убедитесь, что длина разреза превышает один миллиметр. В идеале она должна быть около 1,2 миллиметра. Переместите нож от медиального края трепанации черепа к начальной медиальной координате разреза и медленно опустите нож в кортикальный слой.
После прокалывания твердой мозговой оболочки и проникновения в кортикальный слой нанесите каплю холодного ACSF, чтобы сохранить ткань смазанной и увлажненной. Как только будет достигнута окончательная глубина, переместите нож вдоль медиальной боковой оси. Если ткань волочится вместе с ножом, несколько раз переместите нож вверх и вниз, чтобы убедиться, что ткань разрезается.
Затем продолжайте двигаться вбок, возвращая нож на окончательную глубину. По завершении медленно поднимите нож. При появлении крови очистите место разреза хирургической пеной, пропитанной ACSF, чтобы разбавить и удалить кровь.
Поместите насыщенную пену на открытую кору головного мозга до тех пор, пока она не будет готова для введения микропризмы. Прикрепите микропризму к набору имплантатов. Убедитесь, что визуализирующая сторона призмы противоположна винту опорной плиты.
Прикрепите микропризму к стереотаксической рамке и сориентируйте ее так, чтобы она совпадала с разрезом. Медленно опустите микропризму в место разреза. Сначала удалите ACSF, но как только призма окажется в коре, промойте ее холодной ACSF.
При необходимости добавьте дополнительный ACSF и взбалтывайте кору, перемещая призму вверх и вниз. Покройте открытую область коры головного мозга и линзу защитным слоем силиконового клея, сводя к минимуму избыток клея на окружающем черепе и манекенезе. Теперь расположите головную пластину сзади для правильного размещения имплантата при нанесении цемента.
Выровняйте среднюю линию головной пластины немного правее предполагаемой трепанации черепа, чтобы обе стороны могли быть закреплены во время экспериментов с фиксацией головы. Затем смешайте одну мерную ложку непрозрачного цементного порошка с четырьмя каплями смесителя и одной каплей катализатора, чтобы приготовить адгезивный стоматологический цемент. Нанесите цемент на головную пластину и череп и удерживайте головную пластину на месте, пока цемент не затвердеет.
Нанесите клейкий цемент, чтобы покрыть обнаженный череп и ткани, включая микропризму и головную пластину до тех пор, пока они не станут стабильными. Переместите стереотаксический рычаг вверх, стабилизируя микропризму щипцами, чтобы отсоединить фиктивный микроскоп. Наденьте защитную крышку на объектив и закрепите ее, затянув винт.
Нейроны животных, исследующих открытую арену в темноте, показали сопоставимые уровни флуоресценции и частоты возбуждения во время сеансов с интервалом в три недели.
